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大口黑鲈虹彩病毒lmbv灭活疫苗制备及石斑鱼干扰素刺激基因EcfinTRIM82的功能分析

大口黑鲈虹彩病毒LMBV灭活疫苗制备及石斑鱼干扰素刺激基因EcfinT...

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作者：吕顺友华南农业大学

学位级别：硕士

大口黑鲈(Micropterus salmoides)和石斑鱼(Epinephelus coioides)是我国南方重要经济养殖鱼类,然而目前高密度集约化的养殖模式导致病毒性疾病爆发和流行,严重制约了大口黑鲈和石斑鱼养殖业的健康发展。大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth Ba... 详细信息

大口黑鲈(Micropterus salmoides)和石斑鱼(Epinephelus coioides)是我国南方重要经济养殖鱼类,然而目前高密度集约化的养殖模式导致病毒性疾病爆发和流行,严重制约了大口黑鲈和石斑鱼养殖业的健康发展。大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth Bass Virus,lmbv)是大口黑鲈养殖过程中的一种重要病毒性病原,能导致大口黑鲈大面积死亡。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)是石斑鱼养殖过程中主要的病毒性病原,对仔鱼致死率均超过90%。为了寻找针对lmbv高效和环保的防控手段,以及揭示石斑鱼免疫相关基因在病毒感染复制中的免疫调节作用,本论文开展了lmbv灭活疫苗的制备以及石斑鱼干扰素刺激基因EcfinTRIM82的功能分析,并取得如下研究结果:***灭活疫苗制备及免疫保护效果评价应用FHM细胞增殖lmbv病毒,通过感染实验发现,lmbv对大口黑鲈幼苗的半数致死剂量为5.2×10TCID。以β-丙内脂(BPL)作为灭活剂,发现在4℃0.2%BPL和0.1%BPL条件下将lmbv病毒完全灭活分别需要12 h和3天。0.1%BPL在4℃灭活lmbv病毒,配以铝盐佐剂,制成灭活疫苗。以腹腔注射的方式免疫大口黑鲈幼苗,从血清中和抗体效价和免疫保护率两个指标来评价疫苗的免疫保护效果。实验结果表明,大口黑鲈在接种疫苗后血清的中和抗体效价逐渐升高,在第21天时到达峰值。免疫保护实验结果表明,lmbv灭活疫苗对大口黑鲈免疫保护率达18-23%,疫苗对大口黑鲈有一定的免疫保护效果。2.石斑鱼干扰素刺激基因EcfinTRIM82对病毒感染调节作用机制根据石斑鱼转录组EST序列,克隆了斜带石斑鱼干扰素刺激基因EcfinTRIM82。序列分析表明,EcfinTRIM82编码575个氨基酸。同源性分析表明,EcfinTRIM82与亚洲鲈鱼(Lates calcarifer)和斑马鱼(Danio rerio)fin TRIM82的同源性分别为94%和82%。结构域比对分析表明,EcfinTRIM82含有RING、B box/coiled-coil和SPRY三个保守的结构域。亚细胞定位结果显示,EcfinTRIM82在细胞中呈点状胞质分布。体外过表达实验表明,EcfinTRIM82对SGIV和RGNNV病毒的复制具有显著促进作用,表现为加速病毒诱导的细胞病变进程和促进病毒基因的转录。EcfinTRIM82过表达显著抑制干扰素和炎症反应,包括抑制石斑鱼干扰素相关的信号分子或效应因子(IRF3、IRF7、ISG15、MX I、ISG56和IFP35)以及促炎性因子(TNF-α、IL-8和IL-1β)的转录。而且EcfinTRIM82过表达显著抑制MDA5、MAVS和MITA介导的干扰素和炎症反应。总之,本研究揭示了EcfinTRIM82通过负调控干扰素反应,从而促进虹彩病毒和神经坏死病毒的复制,研究结果为进一步阐明鱼类干扰素刺激基因对病毒感染复制的调控机制奠定了一定基础。

关键词：大口黑鲈 lmbv 灭活疫苗石斑鱼 EcfinTRIM82

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Involvement of the PI3K pathway in Largemouth Bass Virus-induced apoptosis and viral replication

Involvement of the PI3K pathway in Largemouth Bass Virus-ind...

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者： Xiaohong Huang Wei Wang Youhua Huang Liwen Xu Shina Wei Qiwei Qin Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization South China Sea Institute of OceanologyChinese Academy of Sciences South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences

Largemouth Bass Micropterus salmoides is an economically important freshwater fishcultured in *** new emerging viral diseases evoked by iridovirus and rhabdovirus havecaused great economic losses in *** better exploring the pathogenesis of LargemouthBass virus(lmbv),a ranavirus isolate,we investigated the underlying mechanism involved inviral replication and virus induced cell death in *** fluorescence microscopy and flowcytometry,we found that lmbv infection in EPC cells induced typical apoptosis,indicated as theappearance of apoptotic bodies,cytochrome C release and MMP ***,caspaseactivity detection revealed caspase-3,8 and 9 were activated with the infection time,suggestedthat not only mitochondrion-mediated,but also death receptor-mediated apoptosis were involvedin lmbv *** treatment with different inhibitors,viral gene transcription and virusproduction were significantly suppressed by the disruption of proteasome and PI3K ***,both proteasome inhibitor MG132 and PI3K inhibitor LY294002 enhanced virusinduced *** addition,LY294002 also affected the cell cycle alteration induced by ***,we speculated that proteasome system and PI3K pathway played crucial rolesin virus replication by regulated apoptosis evoked by lmbv *** together,our resultsprovided new insights into the molecular mechanism of ranavirus infection.

关键词： Largemouth Bass lmbv apoptosis proteasome PI3K pathway virus replication

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