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作者：古文丽南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景超级增强子相关的 lncRNAs(Super enhancer-associated long non-coding RNAs,SE-lncRNAs)通常转录自超级增强子(Super-enhancers,SEs)区域或其邻近区域或与SEs相互作用,这些区域含有激活增强子H3K4me1、H3K27ac和相关辅助因子(如P300等)的特定染色质状态。SE-lncRNAs可通过结合SEs,与SEs一起调控相关的信号通路及靶基因的表达。随着SE-lncRNAs研究的深入,学者们发现SE-lncRNAs通过复杂的信号网络在细胞的发育分化和肿瘤的发生发展中发挥重要作用。然而,SE-lncRNAs在成骨分化中的作用及调控机制尚未明确。因此,在课题组前期通过染色质免疫共沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation-sequencing,ChIP-seq)鉴定的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成骨分化后特异性 SEs 的基础上,本课题探讨成骨分化后特异性SEs相关的lncRNA linc01485在hBMSCs成骨分化中的作用及分子机制。方法购买hBMSCs细胞扩增传代培养,进行成骨诱导分化,用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western blot、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、ALP活性测定、茜素红染色鉴定成骨分化,同时qRT-PCR检测linc01485、miR-619-5p在成骨诱导过程中的动态表达,分析linc01485和成骨分化因子及miR-619-5p的表达相关性。构建linc01485过表达和linc01485干扰慢病毒载体转染hBMSCs,用qRT-PCR、Western blot、ALP染色、ALP活性测定、茜素红染色检测linc01485对成骨分化的影响。然后,用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)明确linc01485的细胞定位。通过生物信息学数据库预测与linc01485结合的miRNA,在预测结果中选择靶基因为成骨相关基因且预测得分较高的miRNA 进行 RNA 反义纯化(RNA antisense purification,RAP)实验,挑选出与linc01485结合的miR-619-5p,双荧光素酶实验再次验证两者的结合。用生物信息学数据库预测与miRNA结合的靶基因RUNX2,进行实验验证。合成miR-619-5p mimic 和 miR-619-5p inhibitor 转染人骨髓间充质干细胞,qRT-PCR和Western blot实验检测RUNX2的表达水平,Western blot和ALP染色检验miR-619-5p对hBMSCs成骨分化的作用,双荧光素酶实验验证miR-619-5p和RUNX2的结合。最后,采用功能回复实验,即设计合成miR-619-5p inhibitor及miRNA inhibitor NC组转染linc01485干扰组和干扰对照组hBMSCs细胞,Western blot和ALP染色检测人骨髓间充质干细胞的成骨分化情况,以鉴定linc0 1485/miR-619-5p/RUNX2 之间的竞争性内源性 RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络。结果与成骨诱导分化前相比,hBMSCs成骨诱导后的成骨相关因子RUNX2、COL1A1、Osterix(OSX)、OPN、OCN均表达上调,诱导后的ALP染色和茜素红染色为阳性,说明人骨髓间充质干细胞发生成骨向分化。在此过程中,linc01485 与 RUNX2 逐渐上调,miR-619-5p 逐渐降低,miR-619-5p 与linc01485和RUNX2的表达呈负相关。此外,linc01485的表达趋势与RUNX2、OCN、OPN一致,提示linc01485可能与这些基因的功能密切相关。细胞功能实验表明过表达linc01485促进hBMSCs成骨分化,上调成骨因子RUNX2、COL1A1、OSX、OPN、OCN 的表达,提高 ALP 活性,ALP 染色加深,茜素红染色显示钙盐沉积增加。反之,干扰linc01485产生相反的结果。为了探讨linc01485发挥作用的机制,FISH结果表明linc01485主要在细胞质中表达。结合生物信息学预测结果、RAP和双荧光素酶实验,linc01485与miR-619-5p 有效结合,确定 miR-619-5p 为 linc01485 靶标。miR-6

关键词：超级增强子长链非编码RNA linc01485 miR-619-5p 骨髓间充质干细胞成骨分化

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