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limk1过表达对罗格列酮抑制胃癌裸鼠移植瘤的影响

LIMK1过表达对罗格列酮抑制胃癌裸鼠移植瘤的影响

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作者：吴南芳南华大学

学位级别：硕士

目的:通过构建过表达limk1的MGC-803稳定细胞株,观察limk1与罗格列酮(Rosiglitazone,ROS)对胃癌细胞裸鼠移植瘤的影响。方法:构建慢病毒介导的含有过表达limk1的病毒载体系统并对MGC-803细胞进行感染,筛选稳定过表达limk1的细胞株。用q ... 详细信息

目的:通过构建过表达limk1的MGC-803稳定细胞株,观察limk1与罗格列酮(Rosiglitazone,ROS)对胃癌细胞裸鼠移植瘤的影响。方法:构建慢病毒介导的含有过表达limk1的病毒载体系统并对MGC-803细胞进行感染,筛选稳定过表达limk1的细胞株。用q PCR及Western blot对稳定细胞株进行鉴定。收集好OE组、NC组和空白对照组三组细胞接种于裸鼠前肢腋下,观察裸鼠成瘤情况。待移植瘤体积长至100mm3时,在成瘤的三组细胞里随机各均分为两组,每组8只,共6组。实验组予以罗格列酮100mg/kg/2d灌胃处理,对照组予以生理盐水灌胃。每6天测量瘤体的长短径,并称重,以此绘制移植瘤生长曲线图。48天以后,把成瘤的裸鼠处死,检测每组移植瘤的大小、重量并计算抑瘤率。HE染色观察移植瘤形态学变化,免疫组织化学方法和Western blot检测ROS处理后裸鼠移植瘤limk1蛋白表达并进行统计学分析。结果:1.成功地构建了稳定过表达limk1的MGC-803细胞系。用慢病毒介导的过表达limk1的病毒载体去感染MGC-803细胞,检测到细胞的绿色荧光提示病毒成功感染了MGC803细胞,经嘌呤霉素对细胞进行筛选,可观察到细胞的绿色荧光稳定表达。q PCR及Western blot实验显示,过表达limk1的m RNA与蛋白表达水平较空载体组上调,差异有统计学意义(Plimk1的蛋白表达水平,差异无统计学意义(P>0.05)。***对过表达limk1的MGC803细胞裸鼠移植瘤的影响。(1)对移植瘤生长的影响:IMK1过表达组移植瘤的体积及重量明显高于空白对照组和NC组,而ROS灌药组的体积及重量明显低于未灌药组。经计算灌药组均有一定的抑瘤率。(2)对移植瘤形态学的影响:未灌药组较ROS灌药组组的细胞异型性大,细胞间质多,细胞核染色深,核质比多,细胞排列紊乱,其中limk1过表达组最为明显。(3)对移植瘤蛋白表达的影响:各组移植瘤中均有limk1蛋白的表达(棕黄色颗粒,为胞质或胞膜),在40倍物镜下对比观察,以C组(limk1过表达)最为明显,未灌药组(A、B、C)较ROS灌药组(D、E、F)的limk1蛋白表达强。结论:***1过表达可以促进MGC-803细胞裸鼠移植瘤的生长。2.罗格列酮可以抑制MGC-803细胞裸鼠移植瘤的的生长。***1可能是罗格列酮抑制人胃癌MGC-803细胞增殖、迁移及侵袭的作用靶点。

关键词：罗格列酮 limk1过表达 MGC-803细胞裸鼠移植瘤

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二烯丙基二硫对limk1高表达人结肠癌SW480细胞的影响

二烯丙基二硫对LIMK1高表达人结肠癌SW480细胞的影响

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作者：潘志兵南华大学

学位级别：硕士

目的：研究二烯丙基二硫（DADS）及limk1高表达对人结肠癌SW480细胞细胞生物学特性的影响，观察DADS和limk1对裸鼠体内SW480细胞成瘤的影响，探讨DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制。方法：构建含有编码人limk1蛋白的limk1基... 详细信息

目的：研究二烯丙基二硫（DADS）及limk1高表达对人结肠癌SW480细胞细胞生物学特性的影响，观察DADS和limk1对裸鼠体内SW480细胞成瘤的影响，探讨DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制。方法：构建含有编码人limk1蛋白的limk1基因CDS序列的PIRES2-limk1真核表达载体。将PIRES2-limk1真核表达载体转染SW480细胞，建立limk1蛋白高表达稳定转染细胞limk1/SW480细胞。RT-PCR、Westernblot检测DADS处理前后，limk1高表达对SW480细胞limk1mRNA及蛋白表达。MTT法、流式细胞术、划痕实验和Transwell侵袭实验检测DADS处理前后，limk1高表达对SW480细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。裸鼠皮下注入SW480细胞、limk1高表达细胞、limk1干扰细胞分别体外未处理和DADS处理24h后，建立人结肠癌异种移植模型。观察移植瘤生长情况，测量重量与体积，计算抑瘤率，免疫组化分析Vimentin、P53、Ki-67、CD34、E-cadherin蛋白表达。结果：1．成功构建limk1蛋白高表达稳定转染limk1/SW480细胞。酶切和测序结果证实，成功构建PIRES2-limk1真核表达载体。PIRES2-limk1真核表达载体转染SW480细胞，经G418刷选2周后，免疫荧光显微镜下示转染细胞的胞浆内发绿色荧光，RT-PCR和Western blotting检测显示，limk1/SW480细胞中limk1mRNA和蛋白表达量增高（Plimk1高表达的稳定细胞株limk1/SW480。***可下调limk1mRNA和蛋白表达，可抑制limk1和cofilin1的磷酸化，limk1过表达可促进cofilin1的磷酸化。RT-PCR和Western blot检测显示， limk1过表达组、空载体组、SW480组分别加入45mg· L-1DADS作用24小时后，limk1mRNA和蛋白表达量明显降低（Plimk1和P-cofilin1明显减少（Plimk1过表达组P-cofilin1明显高于空载体组及SW480组（Plimk1过表达对SW480细胞cofilin1的表达差异无统计学意义（P>0.05）。***可抑制SW480细胞的增殖、迁移与侵袭，limk1过表达可促进SW480细胞的增殖、迁移与侵袭。MTT结果显示，limk1高表达组增值活性明显高于SW480组及空载体组（Plimk1高表达组、SW480组及空载体组细胞增值活性均受到抑制（Plimk1高表达组愈合明显快于SW480组及空载体组（Plimk1高表达组、SW480组及空载体组细胞划痕愈合速率均受到抑制（Plimk1过表达可促进细胞的迁移能力，DADS可抑制SW480细胞的迁移能力。Transwell实验结果显示，Transwell小室培养细胞24小时后，limk1高表达组穿膜细胞数明显多于SW480组及空载体组（Plimk1过表达可增强SW480细胞的侵袭能力，DADS可抑制SW480细胞的侵袭能力。***可抑制人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的生长，limk1过表达可促进裸鼠移植瘤的生长，沉默limk1可抑制裸鼠移植瘤的生长。实验结果表明，DADS处理后SW480细胞，其移植瘤生长明显受抑制（Plimk1过表达组裸鼠移植瘤生长明显快于SW480组及干扰组（Plimk1后，其裸鼠移植瘤生长明显慢于SW480组及limk1过表达组;免疫组织化学图像分析结果显示，高表达limk1处理SW480组的Vimentin、P53、Ki-67、CD34蛋白的阳性表达（棕黄色颗粒）均明显增高，E-cadherin蛋白的阳性表达明显减少;DADS处理与干扰limk1蛋白的表达都对结肠癌细胞裸鼠移植瘤Vimentin、P53、Ki-67、CD34蛋白表达有抑制作用，而能增加E-cadherin的表达（P过表达可促进SW480细胞的增殖、迁移与侵袭，减弱DADS的抑制作用，与促进cofilin1磷酸化有关。***抑

关键词：二烯丙基二硫 limk1过表达 SW480细胞增殖迁移侵袭裸鼠移植

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