检索结果-南通市图书馆

作者：葛静远上海海洋大学

学位级别：硕士

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作为中国特有的河蚌资源,其所产珍珠精细滑润,光色亮丽。有研究表明雄蚌育珠性能优于雌蚌。近年来,有关三角帆蚌的种质资源保护、产珠性能、病害防治及人工繁育等方面的研究取得了一定成果,而目前关于双壳... 详细信息

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作为中国特有的河蚌资源,其所产珍珠精细滑润,光色亮丽。有研究表明雄蚌育珠性能优于雌蚌。近年来,有关三角帆蚌的种质资源保护、产珠性能、病害防治及人工繁育等方面的研究取得了一定成果,而目前关于双壳贝类性别决定的机制还不清楚,而性别相关基因的研究也不多见。因此,本实验从已有三角帆蚌cDNA转录组库中筛选了3个与性腺发育相关的基因:Dmrta2-1、Dmrta2-2、lhx9,分离鉴定其全长及分析序列结构生物学信息,通过荧光定量表达、原位杂交信号检测及RNA干扰实验研究它们在淡水珍珠蚌性别方面发挥的作用,主要研究结果如下:1.三个基因的克隆及序列分析通过RACE扩增拼接获得基因全长序列,其中Dmrta2亚家族两个基因同源性较高,将其命名为Dmrta2-1和Dmrta2-2。Dmrta2-1核苷酸序列全长1 723 bp(Genbank登录号:MK372349),ORF(Open reading frame)1 158 bp,编码385个aa(amino acid),5’非翻译区(untranslated region,UTR)237 bp,3’UTR为328 bp。预测理论等电点PI/蛋白相对分子量MW为4.97/143293.27,不含信号肽与跨膜区域,Prot Scale程序预测蛋白疏水性表现为亲水性蛋白。Dmrta2-2全长1 682 bp(登录号:MK372348),ORF区1 170 bp,编码389个aa,340 bp的5’UTR与172 bp的3’UTR。PI 6.75,MW 42 568.48,没有预测到信号肽,也没有跨膜区,为亲水性胞内蛋白(平均值为-0.643)。NCBI预测两个Dmrta2基因保守位点,均存在1个DM保守结构域和1个DMA保守基序,且氨基酸序列比对及系统演化树都表明三角帆蚌与池碟蚌(Hyriopsis schlegelii)亲缘度很高,在进化树中聚为一小支,进化地位较保守。lhx9基因cDNA全长为1 931bp(登录号:MN006952),ORF为531 bp,编码176个aa,还包括36 bp的5’UTR与1 364 bp的3’UTR。预测p I/Mw为6.21/20174.25,氨基酸亲疏水性预测指数为负值,即亲水性。NCBI预测存在一个保守的Homebox(HM)同源结构域。同其他物种lhx9氨基酸序列比较相近,发育树中与牡蛎、扇贝聚为一大支,其结构与功能的进化关系比较保守。2.三个基因的qRT-PCR表达分析Dmrta2-1基因在2龄成熟蚌的性腺、鳃、肝脏、肾脏、外套膜、闭壳肌及斧足中均表达,除了肝脏,其它各组织中雌雄表达差异表现为极显著(plhx9在2年龄成体蚌的雌性性腺中出现特异性表达,除去外套膜,在其它各组织的表达都雌性高于雄性,且性腺与斧足中两性差异极显著。早期性腺表达中胚胎发育第3天值最高,其它时间点分布稳定,表达值较低。12-36月龄性腺表达中,雌性均高于雄性,从12-19月龄期间表达量不断下降,之后至36月龄表达量不断上升,但低于12月龄表达值,雄性性腺呈现出相似的变化趋势,但表达丰度很低。由此推测lhx9基因可能参与三角帆蚌雌性性别分化、性腺发育及两性成熟性腺功能稳定的维持。3.三个基因在性腺中的ISH分析在2龄成熟精卵巢原位杂交实验中,Dmrta2-1基因的表达信号在精卵巢中都有检测到,在卵巢中主要位于卵母细胞的细胞膜上,表达信号较强;而雄性存在于滤泡壁,表达信号微弱。同样,Dmrta2-2基因在2龄成熟精卵巢的原位杂交实验,在卵巢中检测到较明显的表达信号,主要存在卵母细胞的细胞膜上,在精巢的滤泡壁中检测到表达信号,推测两个Dmrta2基因都主要在卵巢分化中起作用。lhx9基因在2龄成熟精卵巢的原位杂交实验中,在卵巢卵母细胞的细胞膜上检测到明显的表达信号,在精巢的精细胞中信号很弱,推测lhx9可能主要与三角帆蚌雌性性腺发育及分化过程。***探究基因的功能预实验中通过合成Tra-2a基因ds Tra-1、2、3链,注射7天后检测发现ds Tra-3在雄性性腺中干扰率达到70.44%,雌性为50.98%,为较理想干扰链。正式干扰中累积

关键词：三角帆蚌 Dmrta2 lhx9 性别分化性腺发育

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利用 cut&tag 技术探究 lhx9 基因在颗粒细胞的调控机制

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现代生物医学进展 2023年第24期23卷 4601-4606页

作者：吴婧徐悦曹仁张漫漫乔洁宋怀东上海交通大学医学院附属第九人民医院分子诊断科上海200001 上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科上海200011 上海科技大学生命科学与技术学院上海201210

目的:在人卵巢颗粒细胞癌细胞株KGN中探索转录因子lhx9下游主要的靶基因及其调控。方法:首先我们采用实时荧光定量PCR观察KGN细胞在卵泡刺激素(FSH)干预前后性腺分化和性激素合成过程中重要基因的表达情况,同时我们利用cut&tag测序技术... 详细信息

目的:在人卵巢颗粒细胞癌细胞株KGN中探索转录因子lhx9下游主要的靶基因及其调控。方法:首先我们采用实时荧光定量PCR观察KGN细胞在卵泡刺激素(FSH)干预前后性腺分化和性激素合成过程中重要基因的表达情况,同时我们利用cut&tag测序技术在两组细胞中识别lhx9下游靶基因,并采用双荧光素酶报告实验对重要靶基因NR5A1的调控进行了验证。结果:实时荧光定量PCR结果显示,通过加FSH处理12小时后,lhx9和NR5A1基因的mRNA水平表达降低,相反的,StAR和CYP19A1基因的mRNA水平表达增高;通过cut&tag测序技术和生物信息学分析,我们发现lhx9下游基因主要分布在内吞作用、细胞衰老、肿瘤相关通路、细胞周期、凋亡、卵母细胞减数分裂、雌激素信号转导等通路上。lhx9可以转录调控性腺分化以及类固醇激素合成的一些重要基因,其中包括NR5A1和SOX9等,荧光素酶报告基因证实了lhx9可以直接结合NR5A1基因的启动子区。结论:本研究利用cut&tag测序技术,发现转录因子lhx9对性腺分化和性激素合成的关键基因有转录调控作用,对深入理解lhx9基因对生殖系统的作用具有重要意义。

关键词： lhx9 cut&tag NR5A1 性腺分化

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基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼lhx9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛

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现代生物医学进展 2020年第1期20卷 14-18页

作者：王楠朱惠朱文娇张昌润沈也雷董梅宋怀东乔洁上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科上海200011 上海交通大学医学院附属第九人民医院中心实验室上海200011 上海市南洋模范中学上海200030

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。lhx9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且lhx9基因敲除的小鼠存在性腺发育不... 详细信息

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。lhx9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且lhx9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对lhx9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼lhx9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对lhx9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现lhx9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼lhx9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的lhx9基因进行编辑,发现lhx9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。lhx9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。

关键词： CRISPR/Cas9 lhx9 斑马鱼基因编辑

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