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lgp2蛋白在乌鳢水泡病毒感染斑马鱼ZF4细胞中的作用研究

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LGP2蛋白在乌鳢水泡病毒感染斑马鱼ZF4细胞中的作用研究

作者：王文文华中农业大学

学位级别：硕士

视黄酸诱导基因蛋白受体(RLRs)是—种重要的模式识别受体(PRR)。RLRs通常可识别胞质内病毒的RNA,从而激活其下游的干扰素表达途径,在先天性免疫反应中发挥着重要作用。目前,RLRs家族包括RIG-I、MDA5和lgp2三个成员。本研究克隆了斑马鱼(... 详细信息

视黄酸诱导基因蛋白受体(RLRs)是—种重要的模式识别受体(PRR)。RLRs通常可识别胞质内病毒的RNA,从而激活其下游的干扰素表达途径,在先天性免疫反应中发挥着重要作用。目前,RLRs家族包括RIG-I、MDA5和lgp2三个成员。本研究克隆了斑马鱼(Danio rerio)lgp2基因两个剪切异构体,分别命名为Dr lgp2a和Dr lgp2b;用乌鳢水泡病毒(SHVV)感染斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4,研究病毒感染和RLRs途径的关系。主要结果如下:1.克隆并测定了Dr lgp2a和Dr lgp2b全长c DNA序列,其在NCBI数据库的登录号分别是KP341002和KP341003。Dr lgp2a基因c DNA全长2473 bp,其中5’UTR为50 bp,3’UTR 383 bp,开放阅读框(ORF)为2040 bp,编码679 aa。蛋白结构预测表明Dr lgp2a包含一个ATP依赖的DEXDc结构域,一个RNA解旋酶HELICc结构域和一个调控结构域(RD)。Dr lgp2b是Dr lgp2a的剪切异构体,二者都有DEXDc结构域和HELICc结构域,但Dr lgp2b缺乏RD结构域。2.研究SHVV对斑马鱼ZF4细胞的感染特性:病毒N蛋白和G蛋白的m RNA和c RNA在SHVV感染后3小时表达量显著增加,6小时到24小时逐渐减少;干扰素IFN-αm RNA表达量在病毒感染后6小时显著升高,在12小时达到峰值;干扰素诱导相关基因Mx的m RNA表达量在病毒感染后6小时显著升高,在24小时达到峰值;RIG-I、MDA5和lgp2 m RNA的表达在病毒感染后3小时显著增加,6小时表达量达到最高。这些结果表明SHVV感染ZF4细胞可能激活了RLRs介导的干扰素表达途径。为了确认RLRs-IFN信号途径的激活和病毒感染有关,使用SHVV感染和不感染的ZF4细胞总RNA转染ZF4细胞,结果表明只有SHVV感染3个小时的ZF4细胞总RNA才能诱导IFN-α的显著表达,表明SHVV病毒复制中间体可能参与RLRs-IFN途径的激活。3.采用制备的Dr lgp2-DEXDc多克隆抗体,对病毒感染ZF4细胞lgp2两种异构体进行Western blot检测。结果表明Dr lgp2a的表达量是Dr lgp2b的十倍左右。Dr lgp2a的表达量在病毒感染ZF4细胞12小时的时候显著升高,表明两种lgp2异构体可能在RLRs-IFN途径中起到不同的作用。

关键词：视黄酸诱导基因蛋白受体 lgp2 乌鳢弹状病毒斑马鱼胚胎成纤维细胞干扰素途径

鸭lgp2在RLR介导的抗坦布苏病毒先天免疫中的作用

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鸭LGP2在RLR介导的抗坦布苏病毒先天免疫中的作用

作者：翟新雨山东农业大学

学位级别：硕士

遗传和生理学实验基因2(Laboratory of genetics and physiology 2,lgp2)与维甲酸诱导基因I(Retinoic acid induced gene-I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)同属于模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)中维甲酸诱导基因I样受体(Retinoic acid-inducible gene-Ilike receptor,RLR)的成员,在宿主的先天免疫中发挥着重要的作用。lgp2由于缺乏半胱天冬酶激活招募区(Caspase activation and recruitment domain,CARD),而导致其作为抗病毒反应中的正向或负向调节因子存在争议。鸭坦布苏病毒(Duck Tembus virus,DTMUV)属于黄病毒的一种,可以导致病鸭出现减蛋综合征以及致命性脑炎,给我国的养鸭业带来严重的损害。由于RLR信号通路在抗病毒免疫反应中具有重要的作用,其家族成员是未来抗病毒疗法研发中极具潜力的研究对象。目前对于RLR的研究主要集中在哺乳动物上,在鸭上的研究相对较少。有研究已经证明鸭RIG-I(Duck RIG-I,du RIG-I)和鸭MDA5(Duck MDA5,du MDA5)参与宿主的抗DTMUV先天免疫,而鸭lgp2(Duck lgp2,dulgp2)作为RLR信号通路中的调节因子,其具体作用机制尚未完全清楚。本研究通过构建dulgp2过表达以及敲低型鸭胚成纤维(Duck embryo fibroblast,DEF)细胞,确定dulgp2是否参与鸭先天免疫,以及其在鸭先天免疫中的作用。通过DTMUV感染dulgp2过表达和敲低型DEF细胞,以及慢病毒载体构建的dulgp2过表达基因编辑鸭,从体外和体内两种途径确定dulgp2在宿主抗DTMUV先天免疫中的作用。通过dulgp2与du RIG-I或du MDA5共转染,确定dulgp2与du RIG-I或du MDA5之间是否存在相互作用。主要的研究成果如下:***2在鸭先天免疫中的作用在dulgp2过表达型DEF细胞内,Ⅰ型IFNs(IFN-α和IFN-β)、MAVS、以及抗病毒蛋白(PKR、OAS)、MHCs(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)m RNA表达水平显著降低,dulgp2敲低型细胞内的细胞因子变化大致相反,表明dulgp2参与鸭先天免疫,且可以抑制Ⅰ型IFNs、ISGs以及du RIG-I和du MDA5下游细胞因子MAVS的表达。***2在鸭抗DTMUV先天免疫中的作用dulgp2过表达型DEF细胞感染DTMUV后,细胞内病毒载量明显上调,促炎性细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-8和IFN-γ)、MHC-Ⅱ表达量显著上调,Ⅰ型IFNs(IFN-α和IFN-β)、抗病毒蛋白(PKR和OAS)、TNF-α以及MAVS表达量在早期下调,随后出现上调,MHC-Ⅰ表达量下调。dulgp2敲低型DEF细胞感染DTMUV后,细胞内病毒载量明显下调,IL-2表达量上调,Ⅰ型IFNs(IFN-α和IFN-β)、IL-1β、PKR、MAVS和MHC-Ⅱ表达量在早期上调,在24 hpi或36 hpi表达量恢复到与对照组表达量相似或低于对照组,IL-8、IFN-γ、OAS和MHC-Ⅰ表达量下调。将dulgp2慢病毒表达载体Lv-lgp2与对照慢病毒Lv-NC分别感染DEF细胞,Lv-lgp2感染DEF细胞内dulgp2表达水平升高,且在感染DTMUV后,表达水平进一步升高。dulgp2过表达鸭的脾、肺、肾、脑、胸腺以及法氏囊内的dulgp2 m RNA表达水平均被上调,且在脾、肺、肾组织内上调程度较大,在大脑、胸腺以及法氏囊内上调程度较小。dulgp2过表达基因编辑鸭感染DTMUV后,肺以及脑组织内病毒载量显著上调,肺组织内IFN-γ、IL-8、抗病毒蛋白(PKR和OAS)、MHCs(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)表达量上调,Ⅰ型IFNs(IFN-α和IFN-β)、IL-1β、IL-2、TNF-α、MAVS表达量在1 dpi下调,在3 dpi或5 dpi表达量恢复到与对照组表达量相似或高于对照组。脑组织内促炎性细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-8、IFN-γ和TNF-α)、OAS、MHC-Ⅰ表达量上调,Ⅰ型IFNs(IFN-α和IFN-β)、PKR、MAVS和MHC-Ⅱ在1 dpi时表达量下调,3 dpi时表达量上调,5 dpi时表达量恢复到与对照组水平相似或低于对照组。结合体外与体内实验可得出,dulgp2可以促进DTMUV的复制,并且随着DTMUV载量的不断上调

关键词： lgp2 RLR 先天免疫鸭坦布苏病毒慢病毒

DTMUV调控宿主lgp2蛋白逃逸天然免疫机制的研究

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DTMUV调控宿主LGP2蛋白逃逸天然免疫机制的研究

作者：徐欢长江大学

学位级别：硕士

鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus disease,DTMUVD)是由坦布苏病毒(DTMUV)感染引起的几乎所有品种鸭类的一种急性接触性传染病。除了鸭之外,这种病毒还能感染鸡、鹅和麻雀等禽类。该病具有传播范围广、传播速度快、感染性强的特点。... 详细信息

鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus disease,DTMUVD)是由坦布苏病毒(DTMUV)感染引起的几乎所有品种鸭类的一种急性接触性传染病。除了鸭之外,这种病毒还能感染鸡、鹅和麻雀等禽类。该病具有传播范围广、传播速度快、感染性强的特点。对坦布苏病毒的研究成果日益丰富,但是DTMUV针对宿主的具体致病机理和免疫调控方面的研究机制尚且不清楚还有待挖掘。RIG-I样受体信号通路(RIG-I like receptors,RLRs)在禽类的研究结果远不如哺乳动物丰富,目前的研究结果证明了DTMUV在天然宿主鸭中可调控RLRs信号通路实现免疫逃逸。由于鸡缺少RIG-I基因,DTMUV在鸡中调控RLRs信号通路实现免疫逃逸的研究机制尚不清楚。本研究以DTMUV感染DF-1细胞为体外模型,研究宿主chlgp2蛋白以及DTMUV非结构蛋白NS1对病毒复制的影响。本研究结果主要分为以下三个方面:***在感染早期诱发了DF-1细胞的固有免疫反应以10TCID50剂量的DTMUV感染DF-1细胞,在病毒感染细胞3 h、6 h、12 h和24 h后,收集细胞,qRT-PCR测定RLRs通路细胞因子(lgp2、MDA5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β和STAT1)的mRNA转录水平变化。检测结果显示:相对于对照细胞,在DTMUV感染DF-1细胞3 h、6 h、12 h和24 h后,检测的细胞因子mRNA转录水平均呈现不同的程度的上升。在感染后3 h,细胞因子mRNA转录水平上调最高,lgp2、MDA5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β和STAT1的mRNA转录水平分别上调了1.69倍、2.34倍、2.38倍、2.23倍、1.49倍、1.10倍、2.92倍、1.75倍、1.84倍、1.32倍、1.58倍、1.63倍、2.40倍和1.34倍。结果显示,DTMUV感染DF-1细胞,能够激活宿主的RLRs信号通路,诱发了DF-1细胞的固有免疫反应。***2蛋白对DTMUV复制的影响将pEGFP-N1和pEGFP-N1-chlgp2质粒分别转染DF-1细胞,转染24 h后收集细胞分别进行qRT-PCR和Western blot检测,结果都表明了chlgp2抑制了NF-κB蛋白的表达;利用siRNA敲低chlgp2后,则促进了NF-κB蛋白的表达。在DTMUV感染DF-1细胞3 h、6 h、12 h和24 h后,qRT-PCR结果显示RLRs通路的细胞因子(MDA5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β和STAT1)的mRNA转录水平被chlgp2显著下调,其中在感染3 h后,细胞因子mRNA转录水平下调最为明显,MDA5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β和STAT1的mRNA转录水平分别被下调了0.63倍、0.22倍、0.36倍、0.67倍、0.40倍、0.37倍、0.61倍、0.48倍、0.27倍、0.25倍、0.25倍、0.28倍和0.26倍。利用siRNA敲低chlgp2后,则显著性促进了MDA5、TRADD、TBK1、IKKα、IRF7、NF-κB和IFN-β的mRNA转录水平。Western blot结果显示在DTMUV感染DF-1细胞后,NF-κB蛋白的表达被chlgp2蛋白显著抑制,敲低chlgp2蛋白则得到了相反的结果。这些结果共同表明了chlgp2通过抑制NF-κB介导的信号通路,使DTMUV在DF-1细胞中的复制增强。*** NS1蛋白对DTMUV复制的影响将pEGFP-N1和pEGFP-N1-NS1质粒分别转染DF-1细胞,转染24 h后收集细胞进行qRT-PCR检测,结果显示DTMUV NS1蛋白显著抑制了NF-κB和IFN-β的mRNA转录水平,分别降低了0.84倍和0.61倍。Western blot结果表明DTMUV NS1蛋白显著抑制了NF-κB蛋白的表达。在DTMUV感染DF-1细胞3 h、6 h、12 h和24 h后,qRT-PCR结果显示RLRs通路的细胞因子(MDA5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β和STAT1)的mRNA转录水平被NS1蛋白显著下调,其中在感染3 h后,细胞因子mRNA转录水平下调最为明显,MDA5、MAVS、STING、TRA

关键词：鸭坦布苏病毒 lgp2 NS1 RLRs

中华乌塘鳢lgp2、MDA5和MAVS基因分子克隆及免疫应答分析

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中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因分子克隆及免疫应答分析

作者：周真真浙江海洋大学

学位级别：硕士

中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)是中国一类极富营养价值的经济鱼种,远销港澳等地。但随着人工养殖业的蓬勃发展以及养殖密度的增大,在水体环境中的各类微生物数量增加。当微生物侵染中华乌塘鳢时,会导致产生相关的疾病,影响其养殖业... 详细信息

中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)是中国一类极富营养价值的经济鱼种,远销港澳等地。但随着人工养殖业的蓬勃发展以及养殖密度的增大,在水体环境中的各类微生物数量增加。当微生物侵染中华乌塘鳢时,会导致产生相关的疾病,影响其养殖业的发展,是生产过程中面临的主要问题。中华乌塘鳢是低等脊椎动物,由于特异性免疫并不发达,依赖先天免疫抵抗微生物入侵。先天免疫系统主要是通过TLRs、NLRs和RLRs三类家族识别病原相关分子模式(PAMPs)发挥免疫应答反应,引起促炎细胞因子以及干扰素的表达。其中RLRs是一类新型的胞内识别病毒的模式识别受体家族,在抗病毒免疫反应中发挥重要的作用。这类家族由三个成员组成,它们分别是lgp2(Laboratory of Genetics and Physiology2)、RIG-I(retinoic acid-inducible gene 1)和MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)。结构上,RIG-I和MDA5蛋白在N末端具有两个串联CARD结构域,可以通过CARD-CARD结构域与定位在线粒体膜上的抗病毒信号蛋白(MAVS)相互作用来激活免疫途径,lgp2缺少CARD结构域,但同样有复杂的调控作用。本研究根据实验室转录组中的已有基因序列,通过PCR克隆得到中华乌塘鳢lgp2、MDA5和MAVS基因,并用生物信息学方法分析其分子特征,利用Real-time PCR方法检测中华乌塘鳢lgp2、MDA5和MAVS基因在poly(I:C)感染后的表达水平变化,推测lgp2、MDA5和MAVS基因在中华乌塘鳢抗病毒免疫中的作用。中华乌塘鳢lgp2基因(Bslgp2)的编码序列为2040 bp,编码679个氨基酸。经预测发现Bslgp2蛋白包括DEXDc、HELICc和RD三个保守的结构域。Real-time PCR实验结果说明Bslgp2基因在健康中华乌塘鳢的10个组织中普遍表达,在头肾中表达量最高,而在肠中表达很低。注射poly(I:C)后除脾脏外的其他免疫器官早期Bslgp2基因表达量明显上调。在外周血中Bslgp2基因表达量持续上调(48 h,约158倍);Bslgp2基因表达量在头肾和肝脏中的12 h达到峰值(约17倍和约70倍);而Bslgp2基因在脾脏中早期表达量下调,12 h后表达量迅速上调并在24 h达到最高峰(约1.3倍)。这说明Bslgp2基因可能在先天抗病毒免疫中发挥正调控作用。BsMDA5编码序列为2988 bp,编码995个氨基酸。预测BsMDA5蛋白的结构域是保守的,它们分别是CARDs、DEXDc、HELICc和RD。BsMDA5基因在试验的所有组织中均有表达,在皮肤中表达量最高,其次是外周血,但在肠和脑中表达量很低。相比对照组(PBS)中的BsMDA5基因表达水平变化,在poly(I:C)刺激下的免疫组织中迅速上调,且展现先上升达到峰值后急速下降的趋向。在外周血、头肾和肝脏中BsMDA5在3 h表达量明显上调,在12 h达到最高表达量(约30倍,约3.78倍,约21.78倍)。脾脏中BsMDA5基因表达量在24 h达到峰值(约3.22倍),说明中华乌塘鳢MDA5基因在先天免疫反应中发挥重要的调控作用。BsMAVS编码序列为2484 bp,编码827个氨基酸。预测发现BsMAVS蛋白包括1个保守的CARD结构域和2段内部重复序列(RPT1)。通过Real-time PCR检测BsMAVS基因在正常中华乌塘鳢组织广泛表达,且在头肾和脾脏中表达量最高,而在肠中具有很低的表达量。在poly(I:C)刺激后的外周血、头肾、脾脏和肝脏中,BsMAVS基因表达量在外周血中迅速且明显上调,并持续表达(48 h,约30倍);在头肾中BsMAVS基因的表达量在3 h-12 h呈现下调表达,但在12 h后表达量明显上调,并在24 h达到最高峰(约1.3倍);BsMAVS基因在肝脏中早期表达量上调并达到峰值(3 h,约1.53倍);脾脏中BsMAVS基因表达量在早期下调,6 h后迅速上升并在12 h达到峰值(约1.2倍),推测BsMAVS基因在先天免疫应答反应中发挥重要作用。总之,本研究中克隆了中华乌塘鳢lgp2、MDA5和MAVS基因编码序列,初步研究了lgp2、MDA5和MAVS基因的表达分析。研究结果表明Bslgp2可能在先天抗病毒免疫中发挥正调控作用,是RLR抗病毒信号通路中的正调控因子;BsMDA5基因可能参与先天抗病毒免疫应答并发挥重要作用;BsMAVS基因虽缺失TM结构域,但仍在先天抗病毒免疫反应中发挥作用。这为研究中华乌塘鳢RLR信号途径及相关分子机制奠定基础,对中华乌塘鳢疾病的预防和控制起到一定的指导作用。

关键词：中华乌塘鳢 lgp2 MDA5 MAVS 基因克隆 Poly(I:C) 抗病毒免疫

鸡MDA5、lgp2基因编码区的中性选择分析与遗传分化分析

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鸡MDA5、LGP2基因编码区的中性选择分析与遗传分化分析

作者：刘怡然华南农业大学

学位级别：硕士

近年来,对禽流感病毒及其相关抗性基因的研究逐渐成为生物学和遗传学研究的重点。而鸡缺失禽类抗禽流感的重要基因RIG-1让同一家族的MDA5和lgp2两个基因成为了研究热门。中性检验同样是近年来遗传学研究的重要内容,以中性选择的标准模... 详细信息

近年来,对禽流感病毒及其相关抗性基因的研究逐渐成为生物学和遗传学研究的重点。而鸡缺失禽类抗禽流感的重要基因RIG-1让同一家族的MDA5和lgp2两个基因成为了研究热门。中性检验同样是近年来遗传学研究的重要内容,以中性选择的标准模型为零假设,计算相关统计量,检验其是否偏离中性假设的情况,得到目的区域的受选择情况。本研究将中性检验、多态性分析与基因研究相结合,对MDA5和lgp2两个基因的编码区进行分析,找到候选位点。本实验以华南农业大学保存的杏花鸡、隐性白羽洛克鸡、清远麻鸡、粤黄鸡和丝羽乌骨鸡,广州市江丰实业有限公司保存的文昌鸡,广东海洋大学保存的贵妃鸡和麒麟鸡共8个品种为实验材料,以茂名红火番鸭种苗有限公司的黑羽番鸭为外群,扩增MDA5和lgp2编码区,通过序列分析进行多态性、中性检验相关研究。两个基因各有12和17个多态位点,其中各有一个位点被SIFT软件预测为引起蛋白质功能变化的潜在突变,并发现鸡的不耐受位点比例高于番鸭。而贵妃鸡的MDA5显示出与其他品种不同的高保守性和纯合性。利用Fst参数对两个基因进行品种间比较,发现贵妃鸡的MDA5与其他品种分化较大,Fst值都超过了0.5,显示出极大的遗传分化差异。连锁不平衡分析发现lgp2品种间存在一个单倍型块,并与其他4个位点形成连锁不平衡关系,MDA5存在三个位点两两连锁的情况,这些位点可与被SIFT预测的位点共同作为基因功能研究的候选位点。另外,本实验对两个基因进行品种间中性选择分析,通过Tajima和Fu and Li检验发现丝羽乌骨鸡的lgp2的Fu and Li检验值显著大于0,说明可能存在正向选择或者平衡选择。而以Ka/Ks比例进行品种间中性选择分析,结果显示两个的Ka/Ks值都小于1,并且达到显著水平。这说明鸡MDA5和lgp2两个基因在进化过程中受到过净化选择(负向选择)。综合以上结果,本研究认为MDA5和lgp2耐受能力的差异和负向选择可能是造成鸡与番鸭在感染禽流感病毒后出现发病差异的重要原因。

关键词：鸡中性选择 MDA5 lgp2

鸭lgp2调控RIG-I和MDA5介导的天然免疫信号通路及抗鸭坦布苏病毒作用

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鸭LGP2调控RIG-I和MDA5介导的天然免疫信号通路及抗鸭坦布苏病毒...

作者：李天旭山东农业大学

学位级别：硕士

维甲酸诱导基因I样受体(Retinoic acid-inducible gene-I-like receptor,RLR)是一类重要的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)。哺乳动物RLR家族已经鉴定出了3个成员,分别是维甲酸诱导基因I(Retinoic acid induced gene-I,RIGI)、黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)和遗传和生理学实验基因2(Laboratory of genetics and physiology 2,lgp2)。目前认为lgp2在RLRs的信号转导中主要起到了辅助调控作用,但离彻底了解其机制还有距离。虽然目前已经确认鸭中存在RLRs,而且一些研究也已经证明鸭RIG-I(Duck RIG-I,duRIG-I)和MDA5都参与到了宿主的抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembus virus,DTMUV)天然免疫反应,但是关于dulgp2在RLRs介导的抗病毒天然免疫反应中的调控作用研究很少,本研究将DTMUV作为模式病毒,结果将为进一步认识该病的致病机理及研发新型抗病毒药物或疫苗佐剂提供理论基础。本研究将dulgp2分别与全长duRIG-I或duMDA5以及duRIG-I或duMDA5的半胱天冬酶激活招募区(Caspase activation and recruitment domain,CARD)在鸭胚成纤维(Duck embryo fibroblast,DEF)细胞共表达,通过双荧光素酶报告基因和q RTPCR等方式检测dulgp2对duRIG-I或duMDA5介导的信号通路的调控作用。进一步通过DTMUV感染dulgp2与duRIG-I或duMDA5共表达的DEF细胞,比较上述细胞中的诱导的免疫反应及病毒复制的差异。主要研究结果如下:***2基因的克隆、生物学分析和亚细胞定位研究根据NCBI数据库预测的dulgp2基因序列,从基因编码区两侧设计扩增引物,通过PCR从樱桃谷肉鸭脾脏的c DNA扩增dulgp2的全长编码区序列。序列分析表明dulgp2全长2028 bp,编码675个氨基酸,蛋白大小约为77.5 k Da。dulgp2由DEx D/H-box、HELICc和CTD三个结构域组成。将dulgp2连接至真核表达载体p CAGGS,构建真核表达质粒pdulgp2-Flag并验证了其在DEF细胞中表达并主要定位于细胞质。***2对duRIG-I和duMDA5信号通路的调控作用将已构建的全长duRIG-I和duMDA5或仅含效应结构域CARD的真核重组表达质粒分别与dulgp2真核表达质粒或空载体与萤火虫荧光素酶报告基因质粒和内参对照质粒共转染至DEF细胞。结果表明dulgp2在DEF细胞中以剂量依赖性的方式抑制了duRIG-I和duMDA5介导的IFN-β信号通路。通过q RT-PCR检测发现,全长duRIG-I和duMDA5介导的促炎性细胞因子、Ⅰ型IFN、和下游ISGs的表达被dulgp2显著下调。但是当duRIG-I和duMDA5信号被其CARD结构域所激活时,dulgp2的过表达能够增强促炎性细胞因子的表达。***感染时dulgp2对duRIG-I和duMDA5信号通路的调控作用本研究表明dulgp2在DTMUV感染期间下调了duRIG-I和duMDA5介导的IFN-β信号通路。q RT-PCR结果显示dulgp2在DTMUV感染期间抑制了duRIG-I和duMDA5介导的I型IFN及其下游ISG的表达,而且dulgp2促进了duRIG-I和duMDA5介导的抗DTMUV免疫反应中促炎性细胞因子的表达,增强了duRIG-I和duMDA5介导的炎症反应。这些结果共同表明duRIG-I和duMDA5的抗DTMUV能力被dulgp2下调,最终导致了DEF细胞中DTMUV复制的增强。

关键词：樱桃谷肉鸭 RIG-I MDA5 lgp2 天然免疫调控鸭坦布苏病毒

草鱼MDA5基因和lgp2基因的克隆与表达

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草鱼MDA5基因和LGP2基因的克隆与表达

作者：黄腾西北农林科技大学

学位级别：硕士

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水经济鱼类,养殖规模居“四大家鱼”之首。在具有生长快、肉质好、养殖成本低等优点的同时,草鱼对多种病害的抵御能力较弱是养殖过程中面临的棘手问题之一,每年因病害造成的损失高达数十亿... 详细信息

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水经济鱼类,养殖规模居“四大家鱼”之首。在具有生长快、肉质好、养殖成本低等优点的同时,草鱼对多种病害的抵御能力较弱是养殖过程中面临的棘手问题之一,每年因病害造成的损失高达数十亿元。由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)引起的草鱼出血病是主要病害之一。目前尚无特别有效的药物和方法针对该病毒,而草鱼自身特异性免疫能力不发达在某种程度上导致了疫苗使用效果不佳,因而从先天性免疫途径入手寻找抗GCRV的关键分子为今后草鱼抗病育种奠定基础。在漫长的物种进化过程中多细胞动物保留了许多相似的抗病毒先天性免疫途径,其中以TLR(Toll-like receptors)和RLR(RIG-I-like receptors)等模式识别家族途径为代表。RLR家族途径是哺乳动物中新近发现的重要的抗病毒途径之一,该家族包括3个成员:RIG-I(Retinoic acid-inducible gene-I)、MDA5(Melanoma-differentiation-associated gene 5)和lgp2(Laboratory of genetics and physiology 2),它们各自识别不同类型的胞内病毒核酸分子,并最终激发宿主产生一系列的抗病毒反应,因此阐明鱼类RLR家族在抗病毒过程中的作用具有重要意义。本研究根据基因序列同源比对的结果设计简并引物扩增部分片段,结合cDNA末端快速扩增、半定量RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR及生物信息学分析等技术,克隆了草鱼MDA5 (CiMDA5)和lgp2(Cilgp2)基因,并就其进化关系以及在抗GCRV中发挥的作用进行了相关探索,取得了如下结果: (1) CiMDA5基因的克隆与表达胞浆解旋酶MDA5(黑色素瘤分化相关基因5)识别长的双链RNA病毒分子和5’磷酸基团的单链RNA,并介导I型干扰素的分泌。本研究首次从鱼类中克隆到MDA5基因,并通过研究CiMDA5基因的表达模式揭示其功能。CiMDA5基因的cDNA全长由3233个核苷酸构成,编码含961个氨基酸的蛋白。预测的氨基酸序列主要包括6个结构域:1个CARD(Caspase activation and recruitment domain)、1个DEXDc(DEAD/DEAH box helicase domain)、1个ResIII(Conserved restriction domain of bacterial type III restriction enzyme)、2个HELICc(Helicase superfamily c-terminal domain)和1个RD(Regulatory domain)调控区。CiMDA5基因的mRNA在所有被检组织中均有表达。半定量RT-PCR结果表明CiMDA5基因在正常个体的脾脏、皮肤和鳃的表达量较高,注射GCRV后表达量上调。脾脏中12 h的表达量显著上升(1.80倍,P24 h达到峰值(7.48倍,P0.05)。肝脏中48 h的表达量显著上升(5.00倍,P2 h恢复到正常水平(P>0.05)。 (2) Cilgp2基因的克隆与表达 lgp2与RIG-I和MDA5同源,但缺少CARD结构域。本研究从草鱼中克隆了lgp2基因并对其表达规律进行了研究。Cilgp2基因的cDNA有2920个核苷酸,含5个ATTTA不稳定模体。Cilgp2基因的开放阅读框有2043个核苷酸,编码含680个氨基酸的蛋白,该预测蛋白包括5个主要重叠结构域:2个DEXDc、1个ResIII、1个HELICc以及1个RD调控区。通过同源建模,发现Cilgp2蛋白的RD调控区比人类的lgp2多一个α-helix结构。半定量RT-PCR结果表明Cilgp2基因的mRNA在各组织中均有表达,脾脏、皮肤、心脏和肠的表达量较高,注射GCRV后表达量上调。脾脏中12 h的表达量显著上升(14.50倍,P24 h达到峰值(19.00倍,P24 h表达量显著上升(3.80倍,P2 h下降(5.80倍,Plgp2基因的表达和草鱼抗病毒先天性免疫存在一定的联系,为进一步研究鱼类RLR信号途径奠定了基础。深入了解这两个重要的胞浆病毒识别受体将有助于寻找新的有效手段来预防和控制水产病毒性疾病的感

关键词：草鱼 MDA5 lgp2 基因克隆 mRNA表达分析

模式识别受体lgp2在传染性支气管炎病毒感染中的作用研究

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模式识别受体LGP2在传染性支气管炎病毒感染中的作用研究

作者：崔鹏飞四川大学

学位级别：硕士

传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）是不分节段的单股正链RNA病毒,属于成套病毒目冠状病毒科冠状病毒属的丙型冠状病毒。IBV可以引起鸡急性、传染性呼吸系统疾病,并造成鸡肾脏损伤、蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降,对... 详细信息

传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）是不分节段的单股正链RNA病毒,属于成套病毒目冠状病毒科冠状病毒属的丙型冠状病毒。IBV可以引起鸡急性、传染性呼吸系统疾病,并造成鸡肾脏损伤、蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降,对养禽业造成严重的经济损失。面对病毒感染,宿主对病毒分子的免疫识别是抗病毒免疫应答发生的关键。已有研究表明,视黄酸诱导蛋白I样受体家族的黑色素瘤分化相关蛋白5（Melanoma differentiation-associated 5,MDA5）是识别IBV ds RNA的主要模式识别受体,与MDA5同家族的遗传与生理实验室2（Laboratory of genetics and physiology 2,lgp2）可以在病毒感染过程中发挥多种免疫调节作用,包括促进MDA5信号的传导、诱导干扰素（Interferon,IFN）表达、抑制RNA干扰等,因此研究lgp2在病毒感染过程中的作用有助于阐明宿主对病毒免疫识别的分子机制。本文通过构建鸡完整lgp2（chlgp2）、chlgp2各结构域表达载体以及chlgp2 K30A突变体,利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）、免疫共沉淀、蛋白质谱分析等研究方法,开展chlgp2在IBV感染中的作用研究,并探索chlgp2的作用机制,为研究IBV与宿主的天然免疫识别提供基础。具体研究内容如下:***2对传染性支气管炎病毒在细胞中感染的影响构建Flag标记的chlgp2真核表达载体（pc DNA3.1-chlgp2-Flag）并分别转染至鸡成纤维细胞系（DF-1）和鸡巨噬细胞系（HD11）,通过间接免疫荧光实验验证chlgp2在细胞中的表达;将不同浓度chlgp2转染至HD11细胞和DF-1细胞,于IBV Beaudette株（MOI=1）感染3h、6h、12h、24h、36h、48h时收集细胞和上清;将不同浓度chlgp2转染至DF-1细胞,于IBV M41株（MOI=1）感染3h、6h、12h、24h、36h、48h时收集细胞;通过q RT-PCR检测感染细胞中IBV m RNA和IFNβ的的表达水平,并测定感染36h细胞上清液中IBV滴度。实验结果显示,构建的chlgp2的真核表达载体能够正常在DF-1细胞和HD11细胞表达;chlgp2过表达能够显著抑制IBV Beaudette株在HD11细胞和DF-1细胞中复制（plgp2转染组和对照组并无显著差异（p>0.05）。本章研究结果表明,chlgp2能够显著抑制IBV Beaudette株在HD11细胞和DF-1细胞中复制,不抑制IBV M41株在DF-1细胞中复制。***2结构域和ATPase活性在lgp2抑制IBV过程中的作用构建chlgp2解旋酶结构域和C末端调节结构域（CTD）表达载体,验证chlgp2各结构域在细胞中的表达;通过连续双碱基突变的方式构建chlgp2 K30A突变体;通过q RT-PCR与TCID50检测chlgp2各结构域和chlgp2 K30A突变体对IBV Beaudette株在细胞中复制的影响;通过RNA免疫共沉淀实验检测chlgp2、chlgp2 CTD和chlgp2 K30A突变体结合IBV RNA的能力。实验结果显示,chlgp2解旋酶约为56 KDa,chlgp2 CTD约为31 KDa;chlgp2解旋酶过表达对IBV Beaudette株在细胞中的复制无显著影响（p>0.05）,chlgp2 CTD过表达对IBV的复制有抑制作用,但是病毒复制量显著高于chlgp2转染组;chlgp2 K30A突变体对IBV Beaudette株在细胞中的复制具有抑制作用,其病毒复制量显著高于chlgp2转染组,而且在HD11细胞中,chlgp2K30A突变体未显著促进IFNβ的产生（p>0.05）;RNA免疫共沉淀实验结果显示chlgp2、chlgp2 CTD和chlgp2 K30A突变体都能够结合IBV RNA,其中chlgp2结合IBV RNA的能力最为显著（plgp2在抑制IBV增殖的过程中,chlgp2解旋酶结构域和CTD具有协作性,chlgp2的结构完整性是发挥抑制IBV增殖作用必需的,其ATPase活性也具有关键作用。chlgp2作为模式识别受体,能够识别并结合IBV RNA,促进抗病毒免疫应答的发生,chlgp2 CTD是结合IBV RNA的主要结构域。***2在IBV感染细胞过程中互作蛋白成分分析通过免疫沉淀

关键词：传染性支气管炎病毒 lgp2 解旋酶 C末端调节结构域 ATP水解酶干扰素 TRBP

天然免疫RIG-I样受体lgp2在抗病毒免疫中的作用

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中国动物检疫 2021年第12期38卷 82-90页

作者：邵琦曹琦张佳佳张友文罗佳刘学良夏能文朱建中扬州大学兽医学院扬州大学比较医学研究院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心农业与农产品安全国际联合研究实验室江苏扬州225009

RIG-I样受体(RLRs)是细胞质中重要的模式识别受体(PRRs),lgp2是其重要的家族成员之一。lgp2在抗病毒天然免疫应答中具有特殊功能,能够双向调控RIG-I、MDA5介导的I型干扰素(IFNs)信号通路。在不同病毒感染宿主的过程中,lgp2也表现出明显... 详细信息

RIG-I样受体(RLRs)是细胞质中重要的模式识别受体(PRRs),lgp2是其重要的家族成员之一。lgp2在抗病毒天然免疫应答中具有特殊功能,能够双向调控RIG-I、MDA5介导的I型干扰素(IFNs)信号通路。在不同病毒感染宿主的过程中,lgp2也表现出明显的功能差异。在双链DNA病毒中,lgp2在RIG-I介导的信号传导过程中起正向调节作用;在单链DNA病毒中,lgp2能够促进CARDs区失活的RIG-I与非典型泛素链结合,从而诱导I型IFNs产生;在双链RNA病毒中,正常表达可增强RIG-I、MDA5对dsRNA的识别能力;在正义单链RNA病毒中,lgp2参与对正义单链RNA病毒的识别过程;在负义单链RNA病毒中,lgp2有时可作为IFNs的诱导剂。另外,lgp2在适应性免疫应答中也发挥着重要作用,能够通过不同途径调控T细胞存活与凋亡。目前在调控RIG-I、MDA5介导的信号通路与抗病毒免疫应答中,尚不清楚lgp2发挥的确切功能和其作用机制,未来可进一步加深lgp2在细胞免疫应答中的作用及机制研究。本文就近年来lgp2在RLRs介导的信号通路和抗病毒免疫应答中发挥的作用作综述,以期为lgp2的进一步研究和机体抵御病毒感染新机制提供参考。

关键词： RIG-I样受体 lgp2 信号通路调控作用抗病毒反应