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基于iTRAQ技术分析lcmt1高表达对人胚肾细胞的影响

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基因组学与应用生物学 2018年第5期37卷 2320-2325页

作者：王新航唐深秦富梁紫微刘雨阳肖德强孙斌陆彩玲李习艺广西医科大学公共卫生学院南宁530021 广西医科大学基础医学院南宁530021

lcmt1是重要的哺乳动物甲基转移酶,为了探索lcmt1在生物体内可能涉及的生物进程,并建立lcmt1高表达的差异表达蛋白谱。我们成功构建了lcmt1高表达和质粒对照细胞株,利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absol... 详细信息

lcmt1是重要的哺乳动物甲基转移酶,为了探索lcmt1在生物体内可能涉及的生物进程,并建立lcmt1高表达的差异表达蛋白谱。我们成功构建了lcmt1高表达和质粒对照细胞株,利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ）技术鉴定lcmt1高表达引起的差异表达蛋白,并进行了生物信息学分析。我们共鉴定到4 480个蛋白,差异表达蛋白233个,其中上调蛋白78个,下调蛋白155个。涉及到的细胞生物进程5条,信号通路15条。蛋白质相互作用分析结果表明差异表达蛋白主要分为4群,这些差异表达蛋白主要与RNA翻译与泛素化,肾脏发育,羧酸代谢过程相关。本研究发现lcmt1高表达引起了大量蛋白的差异表达,而这些差异表达蛋白的识别为后续lcmt1相关疾病的研究提供了丰富的理论依据。

关键词： lcmt1 同位素标记相对和绝对定量技术人胚肾细胞蛋白质组

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肝特异性lcmt1基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

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中国实验动物学报 2022年第1期30卷 17-22页

作者：莫娇敖青青郑志坚吴懿洁梁宁静廖思米王新航陆彩玲唐深李习艺广西医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系南宁530021 广西医科大学基础医学院免疫学教研室南宁530021

目的建立肝特异性lcmt1基因敲除小鼠模型。方法运用CRISPR/Cas9技术构建肝特异性lcmt1-KO小鼠。通过RT-PCR、实时定量PCR、Western Blot和HE染色等方法鉴定及比较野生和敲除小鼠的差异;观察和分析两组小鼠的一般情况、繁殖能力和子代存... 详细信息

目的建立肝特异性lcmt1基因敲除小鼠模型。方法运用CRISPR/Cas9技术构建肝特异性lcmt1-KO小鼠。通过RT-PCR、实时定量PCR、Western Blot和HE染色等方法鉴定及比较野生和敲除小鼠的差异;观察和分析两组小鼠的一般情况、繁殖能力和子代存活率。结果成功鉴定子代的基因型;lcmt1-KO小鼠肝lcmt1 mRNA和蛋白质水平显著低于对照组小鼠;两组小鼠的饮食、饮水、体重、繁殖能力、子代存活率、肝外观和HE染色无明显差异;lcmt1-KO小鼠心脏、大脑和肾组织中lcmt1表达与对照组相比没有显著变化;lcmt1-KO小鼠sgRNA未发生脱靶。结论成功构建肝特异性lcmt1基因敲除小鼠,为研究lcmt1基因在疾病中的调控作用提供实验手段。

关键词：肝 lcmt1 Cre/Loxp 基因敲除

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lcmt1通过糖酵解途径促进肝癌细胞增殖的研究

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LCMT1通过糖酵解途径促进肝癌细胞增殖的研究

作者：张宁广西医科大学

学位级别：硕士

背景:原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中主要的病理类型。HCC以恶性程度高和病死率较高为主要特点,患者5年生存率不足15%。有氧糖酵解是恶性肿瘤代谢重编程的特征之一,表现为即使在有氧条件下,肝癌细胞更倾... 详细信息

背景:原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中主要的病理类型。HCC以恶性程度高和病死率较高为主要特点,患者5年生存率不足15%。有氧糖酵解是恶性肿瘤代谢重编程的特征之一,表现为即使在有氧条件下,肝癌细胞更倾向于采用糖酵解的方式供能。靶向糖酵解途径是肿瘤治疗重要发展方向,通过调控糖酵解限速酶活性抑制肿瘤生长。PP2A是重要的肿瘤抑制因子,其催化亚基C亚基(PP2Ac)受甲基化修饰调控。lcmt1是唯一的PP2A甲基转移酶,在调节PP2A全酶的组装和活性中发挥重要的作用。在本课题组前期的体内和体外研究中发现,lcmt1可以调控正常肝细胞糖代谢过程,但其在肿瘤细胞糖代谢中的作用尚不清楚,值得进一步研究。目的:探究lcmt1在HCC组织中的表达特点及其对肝癌细胞增殖和糖酵解途径的影响,为寻找新的HCC治疗靶点提供线索。方法:1.收集2018年12月-2019年6月某院HCC患者术后癌组织和癌旁组织,荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白免疫印迹实验检测lcmt1表达水平。2.利用GEO数据库获取多组HCC患者的癌组织和癌旁组织中lcmt1表达水平的RNA-seq数据,并对数据集进行Mate分析,分析HCC患者癌组织和癌旁组织中lcmt1的表达水平。3.利用Bio Portal肿瘤数据库在线分析网站获取HCC患者肿瘤组织中lcmt1表达水平数据及患者的基本临床资料,根据lcmt1表达水平将研究对象进行分组,分析不同分组之间患者的确诊年龄、肿瘤大小、肿瘤分级等特征是否存在差异,探究lcmt1表达与HCC患者预后的关系。4.采用脂质体法转染技术在Hep G2和Huh7细胞系中构建沉默lcmt1的细胞模型,在Hep3B细胞中构建高表达lcmt1细胞模型。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)阴性对照检测转染效率,蛋白免疫印迹检测lcmt1蛋白表达,确定细胞模型是否构建成功。5.利用上述构建的沉默和高表达lcmt1的细胞模型,采用Cell Counting Kit-8(CCK8)、Ed U增殖检测试剂盒、平板克隆形成实验检测lcmt1对肝癌细胞增殖的作用,采用平面划痕实验检测lcmt1对肝癌细胞迁移能力的影响。6.利用上述构建的沉默和高表达lcmt1的细胞模型,采用葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸激酶(PK)活性检测试剂盒检测沉默和高表达lcmt1对肝癌细胞糖酵解水平的影响;qPCR检测糖酵解过程关键调控基因GLUT1、HK2、PFK2和MCT4 m RNA表达水平的影响。7.获取TCGA数据库中HCC患者肿瘤组织中lcmt1和糖酵解调控基因GLUT1、HK2、PFK2、PKM、LDH和MCT4表达的信息,对HCC患者肿瘤组织中lcmt1与糖酵解调控基因的表达进行相关性分析。结果:1.蛋白免疫印迹和q-PCR结果显示HCC患者癌组织中lcmt1表达水平高于癌旁组织。***分析结果显示GEO数据库中HCC患者癌组织中lcmt1表达水平高于癌旁组织,且不存在发表偏倚。3.分析TCGA数据库结果显示,lcmt1的表达水平在是否为亚洲人种、肿瘤组织学分级、肿瘤大小和家族史中存在差异,其中lcmt1表达水平与肿瘤组织学分级和肿瘤大小呈正相关,即lcmt1表达水平越高,肿瘤组织学分级越差、肿瘤越大,但其他临床特征如诊断年龄、性别、饮酒、HBV感染、T分期、血管侵犯无统计学差异。Kaplan-Meier(K-M)生存曲线分析显示lcmt1高表达的HCC患者的总生存时间和无病生存时间较短,且差异具有统计学意义。***8、Ed U增殖检测试剂盒和q-PCR结果显示,沉默lcmt1抑制Hep G2和Huh7细胞的增殖,降低细胞增殖相关核蛋白MKI67 m RNA水平的表达;高表达lcmt1提高Hep3B细胞增殖能力,上调细胞增殖相关核蛋白MKI67 m RNA的表达;平板克隆形成实验结果显示沉默lcmt1降低Hep G2和Huh7细胞的克隆形成能力;平面划痕实验结果显示沉默lcmt1不影响Huh7细胞的迁移能力。5.葡萄糖含量检测、乳酸含量检测试剂盒、LDH活性、PK活性检测试剂盒和q-PCR结果显示,沉默lcmt1降低Hep G2和Huh7细胞对葡糖糖的利用,降低乳酸的生成,抑制PK和LDH的活性,并降低糖酵解调控基因GLUT1、HK2、PFK2和MCT4 m RNA水平的表达;高表达lcmt1增强Hep3B细胞对葡萄糖的利用和乳酸的生成的能力,增加PK和LDH的活性,并上调糖酵解调控基因GLUT1、HK2、PFK2和MCT4 m RNA水平的表达。***数据库中肝细胞癌患者肿瘤组织中lcmt1表达与糖酵解相关调控基因GLUT1、HK2、PFK2、PK、LDH和MCT4 m RNA表达水平之间存

关键词：肝细胞癌 lcmt1 糖酵解

肝特异性lcmt1基因敲除改善高脂饮食诱导的糖调节受损及其机制研究

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肝特异性LCMT1基因敲除改善高脂饮食诱导的糖调节受损及其机制研究

作者：莫娇广西医科大学

学位级别：硕士

目的:近年来由于饮食结构及生活方式改变,糖调节受损(IGR)的患病率逐年上升,IGR是发展为糖尿病的危险期,也是预防糖尿病发生的黄金时期,因此改善IGR的血糖调节失衡是预防糖尿病发生的重要环节。亮氨酸羧基甲基转移酶1(lcmt1)是依赖S-腺... 详细信息

目的:近年来由于饮食结构及生活方式改变,糖调节受损(IGR)的患病率逐年上升,IGR是发展为糖尿病的危险期,也是预防糖尿病发生的黄金时期,因此改善IGR的血糖调节失衡是预防糖尿病发生的重要环节。亮氨酸羧基甲基转移酶1(lcmt1)是依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移酶,课题组前期的体外研究发现肝细胞lcmt1沉默可调控糖异生和糖原合成,提示lcmt1在血糖平衡中发挥重要作用。本研究利用课题组构建的肝脏特异性lcmt1基因敲除动物,在体内探讨肝脏lcmt1对血糖平衡的影响。通过高脂饮食构建IGR模型,探讨肝脏lcmt1敲除对高脂饮食诱导IGR的影响。通过构建lcmt1和葡萄糖激酶(GCK)双沉默的细胞模型,进一步探讨lcmt1对血糖平衡调控的分子机制。本研究为寻找高脂饮食诱导IGR的关键分子,干预IGR,减少糖尿病的发生提供新的线索。方法:1、小鼠的一般情况检测方法(1)称量小鼠饮食、饮水、体重、肝重,计算肝脏系数。(2)HE染色观察小鼠肝脏组织形态学变化。2、小鼠肝脏糖异生相关指标的检测方法(1)实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏糖异生关键基因的表达。(2)氨基酸分析仪检测肝脏游离氨基酸的丰度。(3)生化试剂盒检测小鼠肝脏甘油三脂含量。(4)LC–MS/MS检测肝脏乳酸和丙酮酸含量。3、小鼠肝脏糖原相关指标的检测方法(1)蒽酮-硫酸比色法检测小鼠肝脏糖原含量。(2)过碘酸-希夫(PAS)染色分析小鼠肝脏糖原水平。(3)LC–MS/MS检测肝脏葡萄糖-1-磷酸含量。(4)实时荧光定量PCR检测肝脏糖原合成与分解关键基因的表达。(5)蛋白免疫印迹检测肝脏GCK蛋白水平。4、小鼠血糖相关指标的检测方法(1)葡萄糖氧化酶法检测小鼠空腹血糖、葡萄糖耐量和胰岛素耐量。(2)ELISA试剂盒检测血清胰岛素,并计算胰岛素抵抗指数。5、小鼠肝脏lcmt1的检测方法(1)实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏lcmt1基因的表达。(2)蛋白免疫印迹检测肝脏lcmt1蛋白水平。6、原代肝细胞的分离与培养两步灌注法和差速离心法来分离和提纯原代肝细胞。用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合物的DMEM/F12培养基培养原代肝细胞。7、si RNA转染MIHA细胞以4 x 10～5个细胞/孔的密度接种在6孔板中,按照说明书使用Lipofectamine 3000和人lcmt1 si RNA、GCK si RNA、非靶向si RNA转染细胞。8、细胞糖原相关指标的检测方法(1)蒽酮-硫酸比色法检测细胞糖原含量。(2)实时荧光定量PCR检测细胞GCK、糖原合酶2(GYS2)和lcmt1基因的表达。结果:1、肝特异性lcmt1基因敲除(L-lcmt1KO)小鼠的一般情况(1)L-lcmt1KO鼠的进食量和饮水量显著高于野生(WT)鼠(Plcmt1KO鼠的肝重和肝脏系数显著高于WT鼠(Plcmt1基因敲除增强小鼠肝脏糖异生(1)L-lcmt1KO鼠肝脏糖异生关键基因丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1和PCK2)、果糖二磷酸酶-1(FBP1)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的表达量显著高于WT鼠(Plcmt1KO鼠肝脏糖异生底物生糖氨基酸、生糖兼生酮氨基酸、生酮氨基酸水平显著低于WT鼠(Plcmt1KO鼠肝脏糖异生底物甘油三酯含量显著低于WT鼠(Plcmt1基因敲除促进小鼠肝脏糖原合成(1)L-lcmt1KO鼠肝脏糖原含量显著高于WT鼠(Plcmt1KO鼠肝脏细胞质的糖原颗粒较WT鼠分布均匀且密度大。(3)L-lcmt1KO鼠肝脏糖原合成中间产物葡萄糖-1-磷酸(G1P)水平显著高于WT鼠(Plcmt1KO鼠肝脏糖原合成关键基因GCK、葡萄糖激酶调节蛋白(GCKR)和GYS2的表达量显著高于WT鼠(Plcmt1KO鼠肝脏GCK蛋白水平显著高于WT鼠(Plcmt1KO鼠肝脏糖原分解基因糖原磷酸化酶(PYGL)水平显著低于WT鼠(Plcmt1基因敲除维持小鼠血糖平衡L-lcmt1KO鼠的空腹血糖、葡萄糖耐量和胰岛素耐量曲线下面积与WT鼠相比无显著性差异。5、肝特异性lcmt1基因敲除保护高脂饮食(HFD)诱导的糖调节受损(1)野生高脂饮食组(WT HFD)小鼠的lcmt1基因和蛋白水平显著高于野生正常饮食组(WT Chow)小鼠(Plcmt1基因和蛋白水平显著低于WT HFD组小鼠(P<0.05)。(2)WT HFD组小鼠的空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指

关键词： lcmt1 肝脏血糖平衡糖调节受损

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lcmt1在肝癌中的表达和预后的意义

天津医科大学学报 2019年第3期25卷 246-250页

作者：廖诗晗赵秀兰张艳辉刘铁菊董学易车娜梁晓辉李逸仙天津医科大学基础医学院病理学教研室天津300070 天津医科大学肿瘤医院病理科天津300060

目的:探讨亮氨酸羧基甲基转移酶1(lcmt1)在肝癌中的表达和预后的意义。方法:通过收集网络数据库GEPIA中有关信息进行lcmt1表达情况的分析、相关性分析和生存分析,然后通过免疫组化染色进一步分析lcmt1在肝癌中的表达和预后。结果:lcmt1... 详细信息

目的:探讨亮氨酸羧基甲基转移酶1(lcmt1)在肝癌中的表达和预后的意义。方法:通过收集网络数据库GEPIA中有关信息进行lcmt1表达情况的分析、相关性分析和生存分析,然后通过免疫组化染色进一步分析lcmt1在肝癌中的表达和预后。结果:lcmt1在肾上腺皮质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌和胸腺瘤中的表达和正常组织的表达相比具有统计学意义(Plcmt1在肝癌中高表达,且高表达的患者生存时间短,更容易发生转移。lcmt1和金属蛋白酶2(MMP2)之间的相关系数为0.324(Plcmt1和丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)存在正相关关系且相关系数为0.76(Plcmt1在肝癌中高表达,且高表达与患者的不良预后有关,lcmt1可能通过激活MAPK3的磷酸化而促进肝癌的发生。

关键词： lcmt1 GEPIA数据库 MMP2 MAPK3 肝癌

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lcmt1和氧化应激的蛋白质组和磷酸化蛋白组研究:lcmt1过表达抑制了H2O2引起的氧化应激损伤

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LCMT1和氧化应激的蛋白质组和磷酸化蛋白组研究:LCMT1过表达抑制...