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PET降解酶的半理性改造及其分子机制研究

PET降解酶的半理性改造及其分子机制研究

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作者：郑晨妮杭州师范大学

学位级别：硕士

塑料难于降解所引起的环境问题正得到越来越多的关注。聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephalate,PET)是用量最大的塑料之一,同时也是最难降解的塑料。随着定向进化技术的不断改进,生物催化很有可能成为解决塑料问题的关键技术之... 详细信息

塑料难于降解所引起的环境问题正得到越来越多的关注。聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephalate,PET)是用量最大的塑料之一,同时也是最难降解的塑料。随着定向进化技术的不断改进,生物催化很有可能成为解决塑料问题的关键技术之一。本项目以目前报道中对PET具有最高降解活性的lcc-iccm(lcc-F243I/D238C/S283C/N246M)为研究对象,首先对其表达及PET降解能力进行初步研究。结果表明lcc-iccm较佳诱导温度为30℃;对PET薄膜降解的较佳反应条件为70℃,p H 8.0,经96 h反应转化率达86%。为了解lcc-iccm工业化应用能力,对其金属活性进行分析,实验数据表明金属离子对酶活性以及其与底物的结合都具有一定的影响。为提高酶的活性和稳定性,通过分子对接、氨基酸结合能分解和位点分析对lcc-iccm进行半理性改造,选择M166、R107、R108、D98、H164和T211六个位点进行饱和突变和迭合突变。其中,结构分析发现M166与Trp190,Tyr95形成氧阴离子穴,将其突变后破坏了蛋白结构,导致酶活性降低;H164位于催化三联体Ser165旁,氨基酸残基的大小变化对Ser165空间位置影响极大,因而突变不利于酶反应。R107,R108突变后破坏了蛋白的α-螺旋结构,导致酶活性降低。98位点的大部分突变体以及211位点部分突变体具有高活性。较佳突变体lcc-iccm-211F对PET的降解效率是野生型的1.5倍,对对硝基苯酚乙酸酯的最适反应温度较野生型提高5℃。根据结构分析推测,98位点位于243位点对面,与243位点一起稳定PET与酶分子的结合,211位点突变酶能够为底物结合提供更大的空间,是影响酶活性的关键位点。突变酶温度稳定性试验表明98位点是影响酶温度稳定性的关键位点。lcc-iccm-211F的最适p H和p H稳定性研究表明突变体的最适p H为8且具有极高的p H稳定性。本实验通过对PET降解酶lcc-iccm进行半理性设计,筛选出影响酶活性和稳定性的关键位点,初步探究活性位点对PET降解的影响,为后续角质酶的研究奠定了基础。

关键词：塑料降解聚对苯二甲酸乙二醇酯 lcc-iccm 半理性设计酶稳定性

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