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lass2基因诱导人肺癌细胞线粒体自噬及其作用机制

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LASS2基因诱导人肺癌细胞线粒体自噬及其作用机制

作者：刘峥璐内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的探究长寿保障基因同源体2(LAG1 longevity assurance homolog2,lass2)诱导人肺癌细胞线粒体自噬的作用及机制,为新型抗肿瘤靶向基因的进一步研究提供必要的理论基础和实验依据。方法(1)运用生物信息学方法分析:lass2基因在肺癌中的... 详细信息

目的探究长寿保障基因同源体2(LAG1 longevity assurance homolog2,lass2)诱导人肺癌细胞线粒体自噬的作用及机制,为新型抗肿瘤靶向基因的进一步研究提供必要的理论基础和实验依据。方法(1)运用生物信息学方法分析:lass2基因在肺癌中的表达情况、与生存预后的相关性、功能和通路的富集情况以及与自噬、线粒体自噬相关通路及通路蛋白的相关性;(2)使用Western blot验证lass2基因沉默组和过表达组细胞模型构建情况;(3)通过透射电镜观察lass2基因沉默和过表达后人肺癌细胞内线粒体和自噬小体的变化;(4)应用JC-1荧光探针检测lass2基因沉默和过表达后人肺癌细胞线粒体膜电位的变化;(5)采用ELISA法分析lass2基因沉默和过表达后人肺癌细胞内ATP6V0C表达量的变化;(6)使用Western blot分析lass2基因沉默和过表达后对人肺癌细胞中线粒体自噬通路相关蛋白p62、PINK1、Parkin、BNIP3L的影响。结果(1)生物信息学分析结果显示:lass2基因在肺癌组织中的表达较癌旁组织显著下调(P=0.0028);在病理T分期中T4期表达较T1期表达显著升高(P=0.0024);在年龄、性别、临床分期、病理M分期、病理N分期的组内比较中,lass2基因的表达量无统计学差异。功能富集分析发现lass2基因显著富集于巨自噬、溶酶体等功能表型。通路评分发现有6条自噬通路和2条线粒体自噬通路与lass2基因具有显著正相关性。在与自噬及线粒体自噬相关蛋白(p62、PINK1、Parkin、BNIP3L、LC3B、Bcl2)的相关性分析中发现,lass2基因与p62和PINK1具有显著正相关性。(2)人肺癌细胞体外实验结果显示:(1)Western blot分析显示,相较于空白对照组和阴性对照组,lass2基因沉默组中lass2蛋白表达水平显著下降(F=27.49,P=0.001),而过表达组中lass2蛋白水平显著升高(F=61.32,P=0.000),表明前期所构建细胞模型有效可用。(2)透射电镜检测显示,相较于空白对照组和阴性对照组,lass2基因沉默组细胞内自噬小体数量减少,而过表达组细胞内自噬小体数量增多。(3)JC-1染色显示,经相同浓度羰基氰化物间氯苯腙诱导后,相较于空白对照组和阴性对照组,lass2基因沉默组细胞中线粒体膜电位下降程度减弱,而过表达组细胞中线粒体膜电位下降程度增强。(4)ELISA检测发现,相较于空白对照组和阴性对照组,lass2基因沉默组细胞内ATP6V0C表达量显著升高(F=138.1,P=0.000),而过表达组细胞内ATP6V0C表达量显著降低(F=8.11,P=0.02)。(5)Western blot分析发现,相较于空白对照组和阴性对照组,lass2基因沉默组细胞中p62(F=12.39,P=0.007)、PINK1(F=79.04,P=0.000)、Parkin(F=14.5,P=0.005)和BNIP3L(F=17.68,P=0.003)蛋白表达水平均显著降低,而过表达组细胞中p62(F=24.42,P=0.001)、PINK1(F=14.91,P=0.028)、Parkin(F=22.97,P=0.002)和BNIP3L(F=28.31,P=0.000)蛋白表达水平均显著升高。结论lass2基因具有正向调控肺癌中线粒体自噬的作用。其机制可能通过下调细胞内ATP6V0C的表达、抑制质子泵作用而导致细胞内H浓度升高,进而诱导线粒体膜电位下降、激活线粒体自噬PINK1-Parkin和BNIP3L信号通路,最终诱导人肺癌细胞发生线粒体自噬。

关键词：肺癌 lass2 线粒体自噬信号通路

lass2通过NDUFS2/ROS/AMPK调控三阴性乳腺癌细胞生物学行为的机制研究

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LASS2通过NDUFS2/ROS/AMPK调控三阴性乳腺癌细胞生物学行为的机制...

作者：赵青青遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨过表达lass对不同三阴性乳腺癌细胞生物学功能的影响及可能分子机制,阐明lass2在三阴性乳腺癌细胞进程中的影响和作用。方法:1.采用Breast Cancer Gene-Expression数据库分析lass2在不同乳腺癌亚型组织中的表达水平,进一步分析... 详细信息

目的:探讨过表达lass对不同三阴性乳腺癌细胞生物学功能的影响及可能分子机制,阐明lass2在三阴性乳腺癌细胞进程中的影响和作用。方法:1.采用Breast Cancer Gene-Expression数据库分析lass2在不同乳腺癌亚型组织中的表达水平,进一步分析lass2表达水平与乳腺癌患者生存期的相关性;qRT-PCR检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和不同亚型乳腺癌细胞中lass2 mRNA的相对表达水平;采用Adv-GFP、Adv-lass2-GFP分别感染不同三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)细胞株(BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-436、)48h 后,qRT-PCR、Western blot验证不同TNBC细胞lass2过表达的体外研究模型是否构建成功;利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,克隆形成试验检测各组细胞克隆能力的变化;Ki-67细胞免疫荧光法分析过表达lass2对各组细胞增殖水平的影响;划痕试验分析lass2过表达对各组细胞迁移能力的作用,Transwell实验分析lass2过表达对各组细胞迁移、侵袭能力的影响;并采用Western blot检测lass2过表达对TNBC细胞线粒体凋亡相关蛋白、EMT及ECM相关蛋白表达水平的影响。2.免疫共沉淀-液相联合质谱法(co-IPLC/MS)鉴定与lass2结合的蛋白复合并构建蛋白互作网络图,生信注释分析并筛选高富集信号通路及其关键结合蛋白,co-IP Western blot验证lass2与关键结合蛋白X的互作关系,内源性免疫荧光验证lass2与关键结合蛋白X的共定位情况;流式细胞术检测MitoSOXTM Red探针标记的各组细胞mtROS水平的变化,Western blot检测过表达lass2对关键结合蛋白信号通路相关蛋白的作用;海马能量代谢仪(Seahorse)分析lass2过表达对ATP生成的影响。3.Western blot检测lass2过表达对ROS-AMPK级联信号通路分子的影响,间接验证lass2对线粒能量代谢的作用。结果:1.Breast Cancer Gene-Expression数据库生信分析发现lass2 mRNA相对表达水平在TNBC亚型组织中表达最低,且Kaplan-Meier分析进一步证明lass2 mRNA相对表达水平与乳腺癌患者DMFS呈正相关,差异具有统计学意义(P2 过表达型(SKBR3)、TNBC(MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、BT-549)中lass2的相对表达水不同程度明显下调,且具有统计学意义(均Plass2-GFP 组 lass2 mRNA 和蛋白相对表达水平均明显上调(均Plass2明显抑制不同TNBC细胞增殖和克隆形成能力(均Plass2过表达抑制不同TNBC细胞的侵袭和迁移能力(均P2.co-IP LC/MS鉴定,GO、KEGG、STRING等生信分析结果提示lass2与“线粒体电子传递链(ETC)/氧化磷酸化(OXPHOS)”信号通路相关蛋白(如线粒体ETC关键蛋白-线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ亚基)存在直接或间接互作关系,生信分析筛选及结合前期研究拟定线粒体复合物Ⅰ(NDUFS2)为lass2互作的关键蛋白;co-IP western blot结果提示lass2与NDUFS2存在互作关系,内源性免疫荧光提示lass2与NDUFS2存在共定位;在不同TNBC细胞中,Adv-lass2-GFP组mtROS的生成较NC组、Adv-GFP组明显增加;Western blot 结果显示 Adv-lass2-GFP 组 ETC 关键蛋白 NDUFS2、UQCRFS1、ATP5A的表达较NC组、Adv-GFP组降低。Seahorse检测结果显示,过表达lass2上调ADP/ATP的比值,抑制ATP生成。3.Western blot 结果显示:Adv-lass2-GFP 组中 p-AMPKα、p-Raptor 的表达水平较NC组、Adv-GFP组均上调,且抑制p-mTOR蛋白的表达。结论:1.生信分析发现lass2 mRNA相对表达水平在TNBC组织中的表达较其他类型乳腺癌低,且lass2 mRNA相对表达水平与乳腺癌患者

关键词：三阴性乳腺癌 lass2 NDUFS2 线粒体电子传递链线粒体氧化磷酸化 AMPK

lass2-3'-非翻译区rs8444单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的相关性研究

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中国肿瘤临床 2017年第3期44卷 107-111页

作者：陈玉锦王海峰颜汝平柯昌兴丁明霞栾婷邹仁超王剑松昆明医科大学第二附属医院泌尿外科云南省泌尿外科研究所昆明市650101 云南省楚雄州人民医院新区肾脏内科

目的:探讨人源性长寿保障基因2(Homo sapiens longevity assurance homologue 2,lass2)-3'-非翻译区(UTR)单核苷酸多态性与中国云南地区膀胱癌人群之间的相关性。方法:选择2011年1月至2015年1月在昆明医科大学第二附属医院就诊且经病理... 详细信息

目的:探讨人源性长寿保障基因2(Homo sapiens longevity assurance homologue 2,lass2)-3'-非翻译区(UTR)单核苷酸多态性与中国云南地区膀胱癌人群之间的相关性。方法:选择2011年1月至2015年1月在昆明医科大学第二附属医院就诊且经病理学确诊的105例膀胱癌作为膀胱癌组、100例非膀胱癌作为对照组进行病例对照研究,对两组患者的膀胱组织进行基因扩增和测序,分析研究lass2-3'-非翻译区单核苷酸多态性与膀胱癌之间的相关性。结果:在lass2-3'-非翻译区仅发现1个单核苷酸多态性位点rs8444,经χ2检验和Logistic回归分析显示,膀胱癌组和对照组rs8444T/C等位基因频率及基因型分布差异具有统计学意义(χ2=10.267,P=0.006;χ2=10.634,P=0.001)。与携带T等位基因或TT基因型相比,携带C等位基因或CC基因型的个体发生膀胱癌的风险显著降低(OR=0.489,95%CI为0.309~0.772,P=0.002;OR=0.258,95%CI为0.081~0.827,P=0.023),但与膀胱癌的TNM分期、病理分级和有否转移无明显相关性(P>0.05)。结论:lass2-3'-非翻译区rs8444C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的发病风险,但与膀胱癌的TNM分期、病理分级和转移情况无关。

关键词： lass2 膀胱癌多态性单核苷酸

lass2/TMSG-1基因沉默对人前列腺癌细胞生物学功能的影响及其机制

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临床与实验病理学杂志 2014年第2期30卷 153-158页

作者：徐晓艳内蒙古医科大学附属医院病理科呼和浩特010059 内蒙古医科大学基础医学院病理学教研室呼和浩特010059

目的探讨lass2/TMSG-1基因沉默对PC-3M-2B4细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用机制。方法将实验分为3组:空白对照组(仅转染PBS的PC-3M-2B4细胞)、无关阴性对照siRNA组及lass2/TMSG-1 siRNA转染组。首先针对lass2/TMSG-1基因,设计并合成... 详细信息

目的探讨lass2/TMSG-1基因沉默对PC-3M-2B4细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用机制。方法将实验分为3组:空白对照组(仅转染PBS的PC-3M-2B4细胞)、无关阴性对照siRNA组及lass2/TMSG-1 siRNA转染组。首先针对lass2/TMSG-1基因,设计并合成siRNA;在脂质体介导下瞬时转染人前列腺癌PC-3M-2B4细胞24 h后分别采用Western blot和RT-PCR技术检测细胞内lass2/TMSG-1蛋白及ATP6L mRNA表达水平;使用BCECF AM H+敏感荧光探针检测转染24、36、48、96 h后3组细胞的细胞内H+浓度;用MTT法检测细胞增殖;划痕修复实验和Transwell体外侵袭实验分别检测PC-3M-2B4细胞的迁移和侵袭能力。结果转染lass2/TMSG-1 siRNA 24 h后,lass2/TMSG-1 siRNA组lass2/TMSG-1蛋白表达与对照组相比下降65%,ATP6L mRNA表达水平与对照组比较提高75%。通过BCECF AM荧光探针检测lass2/TMSG-1 siRNA转染组细胞内H+浓度明显下降,且与空白对照组及无关阴性对照siRNA组相比,差异有统计学意义(P2B4细胞在转染24、48 h后,3组细胞生长速度无明显差异(P>0.05);转染72 h后lass2/TMSG-1 siRNA转染组细胞生长速度明显升高,与空白对照组、无关阴性对照siRNA组比较,差异均有统计学意义(P均lass2/TMSG-1 siRNA 24 h后,与空白对照组及无关阴性对照siRNA组相比,能显著促进细胞迁移和侵袭能力(Plass2/TMSG-1基因表达,同时上调V-ATPase质子泵中关键性亚基—ATP6L mRNA的表达水平,且基因沉默后其细胞内H+浓度下降,提示lass2/TMSG-1基因可能与ATP6L相互作用、共同参与对细胞内pH值的影响,导致肿瘤细胞内外微环境的改变并影响肿瘤细胞的生物学行为,如增殖、迁移及侵袭能力。

关键词：前列腺肿瘤 PC-3M-2B4 lass2 TMSG-1 siRNA

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膜蛋白lass2的表达研究

生物工程学报 2003年第1期19卷 69-73页

作者：蔡兴锋陶震曹郁杨胜利龚毅中国科学院上海生物工程研究中心上海200233

利用多种原核表达系统、真核体外翻译系统和细菌杆状病毒 (BactoBac)的昆虫表达系统对一个具有重要生理功能的人的膜蛋白lass2 (Homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)进行表达研究。在原核表达系统中仅能够表达其羧... 详细信息

利用多种原核表达系统、真核体外翻译系统和细菌杆状病毒 (BactoBac)的昆虫表达系统对一个具有重要生理功能的人的膜蛋白lass2 (Homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)进行表达研究。在原核表达系统中仅能够表达其羧基端胞外区片段却不能表达完整的lass2蛋白 ,并制备了该片段的抗体。完整的lass2蛋白能够在两种真核表达系统中进行表达 ,SDS PAGE分析结果表明 ,表达产物分子量为约 2 8kD的lass蛋白 ,Western印迹分析也证实了这一结果 ,并利用Ni NTA树脂亲和层析将该蛋白纯化 ,纯度达到 90 %以上。

关键词：膜蛋白 lass2 表达研究昆虫表达系统真核体外翻译系统亲和层析

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lass2基因对恶性肿瘤作用机制研究进展

实用医学杂志 2019年第12期35卷 2020-2024页

作者：王侨栾婷王剑松王海峰昆明医科大学第二附属医院泌尿外科/云南省泌尿外科研究所

人源性长寿保障基因Ⅱ型(lass2)又名肿瘤转移抑制基因-1(TMSG1),是新发现的一种肿瘤转移抑制基因,多项研究表明其在肝癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌、脑膜瘤、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中表达下降,有研究显示lass2对... 详细信息

人源性长寿保障基因Ⅱ型(lass2)又名肿瘤转移抑制基因-1(TMSG1),是新发现的一种肿瘤转移抑制基因,多项研究表明其在肝癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌、脑膜瘤、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中表达下降,有研究显示lass2对恶性肿瘤具有促进凋亡及抑制转移等抑癌基因的作用。本文就目前研究lass2对不同恶性肿瘤的作用及其作用机制的进展作一综述。

关键词： lass2 TMSG1 恶性肿瘤肿瘤预后

lass2抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖并促进细胞凋亡的研究

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LASS2抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖并促进细胞凋亡的研究

作者：唐应麒遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:研究lass2对甲状腺乳头状癌细胞增殖、细胞凋亡作用的影响。方法:1.采用免疫组化检测60例甲状腺乳头状癌组织、20例癌旁组织和37例结节性甲状腺肿组织中lass2的表达水平;2.构建Adv-lass2-GFP重组腺病毒并转染甲状腺乳头状癌BCPAP... 详细信息

目的:研究lass2对甲状腺乳头状癌细胞增殖、细胞凋亡作用的影响。方法:1.采用免疫组化检测60例甲状腺乳头状癌组织、20例癌旁组织和37例结节性甲状腺肿组织中lass2的表达水平;2.构建Adv-lass2-GFP重组腺病毒并转染甲状腺乳头状癌BCPAP细胞作为实验组,同时设立空白对照组（NC）及空载组（Adv-GFP）,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹法（WB）检测各组BCPAP细胞中lass2 mRNA及蛋白的表达水平;3.CCK-8法及流式细胞术分别检测各组BCPAP细胞增殖情况、BCPAP细胞周期及凋亡情况,WB法检测各组细胞周期蛋白（CyclinD1）及细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK4）的表达。结果:1.lass2在甲状腺乳头状癌、癌旁及结节性甲状腺肿组织中的表达差异有统计学意义（P＜0.05）;2.成功构建过表达lass2基因的BCPAP细胞;3.CCK-8实验结果提示过表达lass2抑制BCPAP细胞增殖（P＜0.05）,流式细胞术检测三组细胞周期结果提示与NC组和Adv-GFP组细胞相比,Adv-lass2-GFP组细胞发生G0/G1期阻滞（P＜0.05）,流式细胞术检测细胞凋亡结果提示过表达lass2促进细胞凋亡（P＜0.05）,WB检测细胞周期相关蛋白结果提示Adv-lass2-GFP组细胞中CyclinD1及CDK4较NC组与Adv-GFP组低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:lass2在甲状腺乳头状癌中表达下调,过表达lass2抑制BCPAP细胞增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞G0/G1期细胞周期阻滞,其机制可能与CyclinD1及CDK4下调有关。

关键词： lass2 甲状腺乳头状癌细胞周期细胞凋亡细胞增殖

lass2表达对膀胱癌EJ细胞体内致瘤能力的影响及机理探讨

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LASS2表达对膀胱癌EJ细胞体内致瘤能力的影响及机理探讨

作者：栾婷昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]建立裸鼠原位膀胱癌种植模型和皮下膀胱癌种植模型;通过观察瘤灶的部位和数目,检测肿瘤中lass2表达变化,同时检测增殖、凋亡等指标(Bcl-2、Bcl-xL、 Bax、Bim、caspase3、Ki-67)的变化,明确lass2表达对膀胱癌EJ细胞体内致瘤能力... 详细信息

[目的]建立裸鼠原位膀胱癌种植模型和皮下膀胱癌种植模型;通过观察瘤灶的部位和数目,检测肿瘤中lass2表达变化,同时检测增殖、凋亡等指标(Bcl-2、Bcl-xL、 Bax、Bim、caspase3、Ki-67)的变化,明确lass2表达对膀胱癌EJ细胞体内致瘤能力的影响并探讨其机制。[方法]1.建立原位膀胱癌裸鼠种植模型和皮下膀胱癌裸鼠种植模型(1)原位膀胱癌裸鼠种植模型：分别对每组的裸鼠常规消毒并麻醉后,手指挤压裸鼠下腹部排空膀胱内尿液,经尿道插入导管,推进约1cm左右即可进入膀胱,用PBS冲洗膀胱,排空膀胱后向膀胱内注入胰蛋白酶,夹管保留30min后放出胰蛋白酶并用PBS冲洗。在裸鼠排空膀胱后将EJ单细胞悬液灌注入膀胱,并夹管保留1小时,1小时后拔出导管,膀胱自行排空。DMEM膀胱癌细胞培养基作为对照组(2)膀胱癌细胞皮下注射裸鼠转移模型：碘伏消毒裸鼠皮肤,EJ细胞株按常规计数后,使用EDTA/胰酶进行消化,离心后用生理盐水重悬。于每只裸鼠左腋皮下注射入膀胱癌EJ细胞。2.观察裸鼠致瘤情况。一周2次观察裸鼠的状态及饮食情况,通过下腹部触摸膀胱是否有肿块或变硬,挤压膀胱观察是否有血尿,对癌细胞的致瘤情况进行初步判断;脱臼处死裸鼠,详细检查裸鼠的胸腔、腹腔、盆腔等肉眼可见部位的脏器有无肿瘤的出现,据此初步确定肿瘤的转移情况。称取瘤重,绘制肿瘤生长曲线。3.检测lass2及增殖、凋亡等指标变化。应用实时定量PCR、western blot和免疫组织化学检测肿瘤中lass2变化、检测增殖、凋亡等指标(Bcl-2、Bcl-xL、 Bax、Bim、caspase3、Ki-67)。[结果]1.成功建立了原位膀胱癌裸鼠种植模型和膀胱癌细胞皮下注射裸鼠转移模型。2.原位膀胱癌裸鼠种植模型致瘤效果不理想,皮下种植组成瘤率100%。两组模型中的裸鼠均未发现体内脏器转移现象。病理切片观察,皮下移植组和原位移植瘤组均显示肿瘤组织内有大量分化程度低、形态不规则、大小不一、胞质丰富的深着色细胞,细胞核异型性明显,同时可见少量细胞核分裂。3.免疫组化染色后,证实lass2蛋白主要表达于细胞的细胞浆和细胞膜上,少数细胞核中也可以见着染。lass2的表达：正常膀胱组>原位组>皮下组。4.免疫组化对膀胱肿瘤组织和皮下肿瘤组织的Ki67蛋白进行检测,结果显示对照组2家族各因子,结果显示Bcl-2和Bcl-xl呈现高表达,Bcl-2在皮下种植瘤和原位种植瘤组织中的表达明显较正常膀胱组织高;而Bcl-xl在原位种植瘤组织中的表达高于其他两组,差异均具有统计学意义;Bax和Bim均呈现低表达,Bax在各组中的表达水平无明显差异;而Bim在皮下种植瘤的表达水平明显低于正常膀胱组织,原位种植瘤和正常膀胱组织中的Bim表达也无明显差异。6.对caspase3、lass2和ki67进行了mRNA和蛋白水平的检测,结果显示：caspase3在各组组织中的表达无统计学差异;lass2在正常膀胱组织中的表达较其他两种肿瘤组织中的表达显著升高,差异具有统计学意义;而ki67在皮下种植瘤组织中的表达较其他两种肿瘤组织中的表达显著升高,差异也具有统计学意义。[结论]1.原位膀胱癌裸鼠种植模型致瘤效果不理想,成瘤率极低,而皮下移植瘤成瘤率为100%。两组模型体内均未见重要脏器转移,转移能力不确切,lass2基因对于膀胱癌细胞体内转移能力的影响有待进一步的研究检测。2.在原位种植组的膀胱组织中,lass2的表达明显低于对应的正常膀胱组织组。同皮下实体瘤组织比较,原位种植组的lass2水平提高。原位种植组肿瘤和皮下种植组肿瘤组织中Ki67的蛋白染色均较对照组的表达显著升高。这提示我们lass2的表达可能影响体内膀胱癌细胞的成瘤能力,lass2对肿瘤增殖能力的影响可能与ki67的表达改变有关。

关键词： lass2 膀胱癌体内致瘤能力机理

lass2介导Nrf2调控的Ⅰ型子宫内膜癌孕激素耐药机制研究

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LASS2介导Nrf2调控的Ⅰ型子宫内膜癌孕激素耐药机制研究

作者：杨彬南昌大学

学位级别：硕士

研究目的:对于有生育要求的早期Ⅰ型子宫内膜癌患者,孕激素为保守治疗的首选方法,临床中有30%患者对孕激素治疗耐药,本课题拟探索Nrf2/lass2对子宫内膜生物学功能及孕激素治疗敏感性影响的分子机制,以期寻求预测孕激素敏感性的分子标志... 详细信息

研究目的:对于有生育要求的早期Ⅰ型子宫内膜癌患者,孕激素为保守治疗的首选方法,临床中有30%患者对孕激素治疗耐药,本课题拟探索Nrf2/lass2对子宫内膜生物学功能及孕激素治疗敏感性影响的分子机制,以期寻求预测孕激素敏感性的分子标志物,为临床治疗方式的选择及靶向药的发现提供依据。研究方法:1.lass2基因序列分析,lass2中ARE序列荧光报告基因质粒构建,Luciferase检测Nrf2-lass2基因关系;2.RT-PCR检测雌激素对子宫内膜癌细胞中Nrf2-lass2表达的影响;数据库检索基因相关性;3.Western Blot及免疫荧光实验分析不同子宫内膜细胞种类中,Nrf2-lass2表达差异;4.免疫组织化学分析Nrf2-lass2在不同生理病理阶段子宫内膜组织中表达差异;5.细胞凋亡实验检测lass2基因对子宫内膜癌细胞凋亡的影响;6.Nrf2/lass2质粒或siRNA转染子宫内膜癌细胞,Western Blot检测细胞转染效率,并通过细胞增殖与活性检测分析其对孕激素治疗敏感性的影响;7.lass2/sh lass2质粒转染及(或)外源性药物二甲双胍(Metformin)处理,Western Blot检测Nrf2-lass2蛋白表达变化,及细胞增殖与活性检测分析;平板克隆实验检测药物对细胞克隆形成的影响。研究结果:1.lass2基因序列分析显示3个ARE序列,构建对应ARE序列荧光报告基因质粒,Luciferase检测结果显示Nrf2通过ARE序列正向调控lass2基因;2.外源性雌激素作用显著上调子宫内膜癌细胞中Nrf2-lass2 m RNA表达水平,TCGA数据显示Nrf2高表达量患者远期存活率低于低表达量患者,GEPIA基因相关性分析显示Nrf2/lass2在子宫内膜组织细胞中表达呈相关性;3.Western Blot及免疫荧光实验结果显示:子宫内膜原代细胞及间质细胞中Nrf2-lass2蛋白表达量显著低于肿瘤细胞;4.免疫组织化学结果显示Nrf2-lass2在子宫内膜异常增生组织/肿瘤组织中表达量高于正常(增殖/分泌期)组织;5.子宫内膜癌细胞中敲减lass2促进肿瘤细胞凋亡;6.子宫内膜癌细胞中Nrf2/lass2与孕激素治疗敏感性呈现负相关性;7.Metformin抑制Nrf2-lass2蛋白表达从而抑制细胞增殖,增强孕激素治疗敏感性,并显著抑制肿瘤细胞克隆形成效率。结论:1.lass2介导Nrf2调控的Ⅰ型子宫内膜癌的发生发展,并与患者不良预后正相关;2.lass2介导Nrf2调控的子宫内膜癌孕激素治疗敏感性;3.Metformin可抑制Nrf2-lass2表达,强化孕激素治疗敏感性。

关键词： Nrf2 lass2 子宫内膜癌孕激素耐药性激素