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布鲁菌l7/l12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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动物医学进展 2018年第12期39卷 10-14页

作者：成璐张冬星吴娟李影吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

为制备布鲁菌(Brucella)l7/l12蛋白及其小鼠源多克隆抗体,根据猪布鲁菌(Brucella suis)S2株l7/l12基因序列,设计合成特异性引物,PCR扩增l7/l12基因并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-l7/l12,经鉴定正确后转化... 详细信息

为制备布鲁菌(Brucella)l7/l12蛋白及其小鼠源多克隆抗体,根据猪布鲁菌(Brucella suis)S2株l7/l12基因序列,设计合成特异性引物,PCR扩增l7/l12基因并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-l7/l12,经鉴定正确后转化至大肠埃希菌Bl21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为17ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western blot结果表明,原核表达后纯化的l7/l12蛋白能够与制得的小鼠抗l7/l12蛋白多克隆抗体特异性结合。成功获得了纯化的l7/l12重组蛋白和小鼠抗l7/l12多克隆抗体,为进一步研究l7/l12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定了基础。

关键词：布鲁菌 l7/l12蛋白原核表达多克隆抗体

布鲁氏菌l7/l12蛋白对MAPK信号通路的影响

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布鲁氏菌L7/L12蛋白对MAPK信号通路的影响

作者：张广林甘肃农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌是寄生在细胞内并能感染人和动物的革兰氏阴性小杆菌,布鲁氏菌的许多蛋白能引起机体一系列的免疫反应,其中l7/l12蛋白是公认的T细胞免疫优势抗原,而且编码l7/l12蛋白的基因在各种间相对保守。目前主要集中于研究布鲁氏核糖体蛋... 详细信息

布鲁氏菌是寄生在细胞内并能感染人和动物的革兰氏阴性小杆菌,布鲁氏菌的许多蛋白能引起机体一系列的免疫反应,其中l7/l12蛋白是公认的T细胞免疫优势抗原,而且编码l7/l12蛋白的基因在各种间相对保守。目前主要集中于研究布鲁氏核糖体蛋白l7/l12用作疫苗来预防疾病,而对其致病机制研究尚少,本试验设计了编码l7/l12核糖体蛋白基因的引物,扩增l7/l12基因并与原核表达载体p ET30a和真核表达载体p EGFP-N连接后,用原核表达的l7/l12核糖体蛋白刺激DCs细胞来分析和探讨该蛋白对小鼠髓源DCs成熟、功能的影响,通过转染293t细胞来分析l7/l12核糖体蛋白对MAPK信号通路的影向,该研究为布鲁氏菌l7/l12核蛋白后续免疫学机制的研究奠定了基础。(1)构建重组质粒p ET30a-l7/l12后并将其转入大肠杆菌Bl21(DE),筛选出最佳诱导条件并获得大批量的可溶性重组蛋白,用Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western免疫印迹分析蛋白的纯度和反应原性。结果显示,经1 m M的IPTG诱导剂、16℃过夜诱导时蛋白以可溶性形式高效表达,SDS-PAGE检测蛋白大小为18 KD,与预测值相符,重组蛋白的纯度达到93%以上,免疫印迹显示重组蛋白具有良好的反应原性。(2)在小鼠后肢骨中分离骨髓细胞,用Il-4和GM-CSF成功诱导、分化成DCs,用lPS和l7/l12蛋白刺激24 h,收取刺激后的DCs,用流式检测表面共刺激分子,用RT-QPCR检测炎症因子和MAPK信号通路节点分子的变化。结果显示,被刺激的BM-DC细胞表面CD40、CD80等抗原分子的表达显著高于空白对照组(Pl-1β、Il-12极显著高于空白对照组(Pl7/l12核糖体蛋白作用后,MAPK和JNK的表达量上调,但是p38和ERK分子仅有微小的上调。证明l7/l12蛋白能够刺激树突状细胞分化、成熟,促进DCs递呈抗原至初始T淋巴细胞发挥细胞免疫。(3)将试验扩增的l7/l12基因与真核表达载体p EGFP-N质粒连接,用脂质体2000将p EGFP-N-l7/l12重组质粒转入至293t细胞中。提取细胞总RNA并反转录为c DNA,用普通PCR来检验重组质粒是否得到有效表达,用Western印迹分析蛋白的反应原性,用RT-QPCR检测MAPK信号通路的节点分子变化。结果显示荧光显微镜下观察其转染效率在80%以上,普通PCR产物经核酸电泳后可见l7/l12目的基因条带,Western印迹分析在PVDF膜上清晰可见抗原抗体的反应条带,RT-QPCR检测结果显示MAPK信号通路的ERK和JNK节点分子的RNA表达量明显上升,说明重组蛋白在293t细胞的细胞质中得到有效表达后可以将信号传至细胞核中,刺激细胞所产生的生长因子作用于某些关键调控因子,最终可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、调节细胞周期。结论:(1)诱导表达的重组蛋白可刺激树突状细胞分化、成熟;(2)l7/l12核糖体蛋白可以刺激树突状细胞发生炎症反应。(3)l7/l12核糖体蛋白对体外培养的树突状细胞和293t细胞的MAPK信号通路产生影响

关键词：布鲁氏菌 l7/l12蛋白 DC细胞 293t细胞 MAPK信号通路

载体介导的布鲁氏菌l7/l12疫苗研制现状

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中国病原生物学杂志 2019年第7期14卷 864-866页

作者：李文桂陈雅棠重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所

布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是一种严重危害人类健康的人畜共患传染病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。l7/l12蛋白是一种有效的疫苗候选分子,本文综述鼠伤寒沙门氏菌、乳酸乳球菌、大肠埃希菌、酿酒酵母和禽流感病毒等载... 详细信息

布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是一种严重危害人类健康的人畜共患传染病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。l7/l12蛋白是一种有效的疫苗候选分子,本文综述鼠伤寒沙门氏菌、乳酸乳球菌、大肠埃希菌、酿酒酵母和禽流感病毒等载体介导的布鲁氏菌l7/l12疫苗的研制现状。

关键词：布鲁氏菌 l7/l12蛋白疫苗综述

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、l7/l12基因的原核表达载体构建及表达

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中国人兽共患病杂志 2005年第11期21卷 961-964页

作者：司瑞白文涛张芳琳刘艳丽胡刚吴兴安阎岩徐志凯第四军医大学微生物学教研室西安710032

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和l7/l12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原l7/l12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入p... 详细信息

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和l7/l12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原l7/l12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

关键词：羊布鲁氏菌 BCSP31蛋白 OMP31蛋白 l7/l12蛋白基因表达

布鲁菌二联BCSP31-l7/l12-Il-2嵌合病毒样颗粒疫苗候选株的构建与鉴定

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中国兽医学报 2023年第5期43卷 865-871页

作者：邹映雪黄天鸿冯嘉轩丁佳欣陈铭桦陈凯楠郭春红张頔丁壮吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

布鲁菌病的传统疫苗存在接种后干扰血清学诊断及可能出现毒力返强等缺点,严重干扰疫病监测,影响疫病净化。因此,本研究基于新城疫病毒样颗粒(ND virus like particles,ND VlPs)载体平台,利用昆虫杆状病毒表达系统和GPI锚定策略,以免疫... 详细信息

布鲁菌病的传统疫苗存在接种后干扰血清学诊断及可能出现毒力返强等缺点,严重干扰疫病监测,影响疫病净化。因此,本研究基于新城疫病毒样颗粒(ND virus like particles,ND VlPs)载体平台,利用昆虫杆状病毒表达系统和GPI锚定策略,以免疫增强因子Il-2、高保守性的保护性抗原蛋白l7/l12(来源猪种S2株)和羊种BCSP31蛋白(来源羊种M5株)为靶点,构建绿色、安全的布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒新型疫苗候选株(BCSP31-l7/l12-Il-2 cVlPs)。PCR及免疫荧光结果表明成功构建了表达Il-2和l7/l12蛋白的重组杆状病毒,Western blot结果显示该cVlPs各组分蛋白正确表达,透射电镜观察可见表面展示纤突结构、大小约为100 nm的粒子,表明布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒BCSP31-l7/l12-Il-2 cVlPs构建成功。

关键词：布鲁菌新城疫病毒样颗粒载体二联嵌合型病毒样颗粒疫苗 l7/l12蛋白 BCSP31蛋白

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布鲁氏菌l7/l12的克隆与表达

布鲁氏菌L7/L12的克隆与表达

布氏杆菌pCDNA3.1-l7l12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

第二届全国人畜共患病学术研讨会

作者：丁平高君谭其军曾政重庆市动物疫病预防控制中心西南大学动物科技学院

布鲁氏菌病是由细胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。它以发热,流产为主要症状,严重威胁着人畜健康。本研究以布鲁氏菌M16基因组DNA为模板采用PCR技术扩增375bp的布鲁氏菌l7/l12编码基因,并克隆至原核表达载体PE... 详细信息

布鲁氏菌病是由细胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。它以发热,流产为主要症状,严重威胁着人畜健康。本研究以布鲁氏菌M16基因组DNA为模板采用PCR技术扩增375bp的布鲁氏菌l7/l12编码基因,并克隆至原核表达载体PET32a(+),成功构建了PET32a-l7/l12重组质粒,目的蛋白以可溶性形式高效表达,利用离子交换层析纯化重组蛋白,纯度可达94%,免疫印迹显示表达的重组蛋白具有良好的抗原性。为布鲁氏菌的诊断和新型疫苗研究奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌 l7/l12蛋白重组蛋白

来源： cnki会议评论

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免疫学杂志 2004年第3期20卷 208-212页

作者：曾政王英赵光宇周华于三科韩岳罗德炎马丽娟王希良军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨陵712100

目的　获得布氏杆菌保护性抗原l7 l12重组蛋白及pCDNA3.1 l7 l12重组质粒 ,并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法　PCR扩增布氏杆菌核蛋白l7 l12基因分别构建至原核表达载体PET32a(+)和真核表达载体pCDNA3.1(+)中 ;pET32a l7 l12重... 详细信息

目的　获得布氏杆菌保护性抗原l7 l12重组蛋白及pCDNA3.1 l7 l12重组质粒 ,并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法　PCR扩增布氏杆菌核蛋白l7 l12基因分别构建至原核表达载体PET32a(+)和真核表达载体pCDNA3.1(+)中 ;pET32a l7 l12重组质粒转化Bl2 1(DE3) ,所表达蛋白经SDS PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠 ;pCDNA3.1 l7 l12重组质粒配以GM CSF同时肌肉注射免疫小鼠 ,3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果　ElISA、Westernblot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生 ,蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗 ;通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1 型免疫为主。结论　所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力 ,DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗 ,可作为潜在的布氏菌新型疫苗。

关键词：布氏杆菌 l7/l12蛋白 DNA疫苗

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酸性核糖体磷酸化蛋白P0的研究进展

现代医药卫生 2010年第1期26卷 73-75页

作者：刘鑫唐圣松南华大学肿瘤研究所湖南衡阳421001

原核生物和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类与蛋白质翻译密切相关的酸性核糖体磷酸化蛋白。在真核生物它们是酸性核糖体磷酸化蛋白P0，P1，P2（acidic ribosomal phosphoproteins PO。P1andP2），而在原核生物如Escheriehiacoli... 详细信息

原核生物和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类与蛋白质翻译密切相关的酸性核糖体磷酸化蛋白。在真核生物它们是酸性核糖体磷酸化蛋白P0，P1，P2（acidic ribosomal phosphoproteins PO。P1andP2），而在原核生物如Escheriehiacoli体内，它们分别为lIO和l7／l12蛋白．其中与P0蛋白相对应的蛋白为lIO，与P1、P2蛋白相对应的蛋白为l7／l12。原核生物和真核生物的酸性核糖体磷酸化蛋白在结构和功能上具有高度的同源性，所不同的是在原核生物，l7／l12蛋白是由同一基因编码的，

关键词：磷酸化蛋白核糖体酸性 PO l7/l12蛋白原核生物真核生物蛋白质翻译