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人乳头瘤病毒-16 l1蛋白抗体的制备及应用

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中国生物制品学杂志 2020年第8期33卷 908-911页

作者：刘传志卞文治梁雨萍长春理工大学生命科学技术学院吉林长春130022

目的制备人乳头瘤病毒-16(human papillomavirus type-16,HPV-16)l1蛋白抗体,并验证HPV-16鼠源单抗的特性。方法以HPV-16 l1蛋白分别免疫BAlB/c小鼠及新西兰大耳白兔,制备HPV-16鼠源单抗及兔血清多抗,建立检测HPV-16抗体的双抗夹心ElIS... 详细信息

目的制备人乳头瘤病毒-16(human papillomavirus type-16,HPV-16)l1蛋白抗体,并验证HPV-16鼠源单抗的特性。方法以HPV-16 l1蛋白分别免疫BAlB/c小鼠及新西兰大耳白兔,制备HPV-16鼠源单抗及兔血清多抗,建立检测HPV-16抗体的双抗夹心ElISA方法;鉴定鼠源单抗的特异性、热稳定性,并验证方法的准确性。结果制备的HPV-16鼠源单抗最高效价为5.5×10^6,兔血清多抗效价为2.25×10^7。该鼠源单抗仅与灭活病毒HPV-16呈阳性反应,而与灭活病毒HPV-18、HPV-52及HPV-58无交叉反应,于37℃保存6 d,蛋白稳定性良好;灭活HPV-16浓度在1~50μg/ml范围内时,检测偏差率在5%以内。结论成功制备了HPV-16鼠源单抗,其特异性强,热稳定性良好,建立的双抗夹心ElISA法检测准确,为早期临床HPV筛查及治疗效果评价提供了可能。

关键词：人乳头瘤病毒-16 宫颈癌 l1蛋白单克隆抗体多克隆抗体

人乳头瘤病毒58型l1蛋白B细胞表位预测和分析

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中国病原生物学杂志 2017年第5期12卷 407-411,415页

作者：宋易玲叶晓鲜毛珊珊岑丹维张婵琼蒋朋飞张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(l1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型l1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综... 详细信息

目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(l1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型l1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综合分析和预测。结果通过亲水性参数,Zimmcrman极性,柔韧性参数,表面可及性及抗原性进行综合分析,预测人乳头瘤病毒58型l1蛋白的B细胞表位可能位于其N端的29-37,43,46-58,64-67,74,79-88,93,100-101,103-125,133-139,149,151-180,187-213,220-213,235,238-247,252-271,277-282,286-309,320-323,327-338,341-348,351,353-368,373-396,408,427,419-425,433-444,453-468,470,475-486,488-490,493-494,497-524肽段区域;进一步用Protien Plast在线同源匹配分析,79-88、190-216、373-396、453-468、497-524肽段区段为可能的B细胞表位。结论用多参数预测分析HPV58型l1蛋白可能的B细胞表位,为进一步研究高危型58型l1蛋白的生物学特性提供了理论基础。

关键词：人乳头瘤病毒58型(HPV58) B细胞表位 l1蛋白同源性匹配分析

人乳头瘤病毒31和33型l1蛋白类病毒颗粒的制备及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2014年第12期27卷 1508-1511,1516页

作者：高波张靖张学峰王立莉梁宇李启明北京生物制品研究所有限责任公司北京101111 北京天坛生物制品股份有限公司北京100024

目的采用汉逊酵母系统表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31和33型l1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VlPs),纯化后检测其免疫原性。方法将表达HPV31和HPV33 l1蛋白的重组汉逊酵母工程菌经高密度发酵,收集菌体,进行高压... 详细信息

目的采用汉逊酵母系统表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31和33型l1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VlPs),纯化后检测其免疫原性。方法将表达HPV31和HPV33 l1蛋白的重组汉逊酵母工程菌经高密度发酵,收集菌体,进行高压均质破碎后,采用亲和层析法纯化HPV31和HPV33 l1 VlPs,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白,透射电镜观察VlPs形态,动态光散射仪分析VlPs粒径大小及分布情况。将BAlB/c小鼠随机分为3组:HPV31 l1 VlP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)、HPV33 l1 VlP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)和佐剂对照组(铝含量0.24 mg),分别于0、1、3周经腹腔注射免疫小鼠,于每次免疫后1周经眼球采血,分离血清,采用假病毒中和试验检测血清中和抗体滴度。结果纯化的HPV31和HPV33 l1重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与HPV l1通用型单克隆抗体发生特异性结合。经透射电镜及动态光散射观察,可见VlPs形成,但部分l1蛋白以五聚体的壳粒形式存在,未包装成颗粒。HPV31和33 l1 VlPs初次免疫后1周,即能诱导BAlB/c小鼠产生较高滴度的血清中和抗体,且明显高于佐剂对照组(Pl1 VlP组和HPV33 l1 VlP组免疫小鼠血清中和抗体滴度也相应增加。结论应用汉逊酵母可高效表达HPV31和HPV33 l1重组蛋白,并形成VlPs。用含铝佐剂的重组蛋白免疫BAlB/c小鼠,具有较好的免疫原性,可作为多价重组HPV疫苗的组分抗原。

关键词：人乳头瘤病毒31型人乳头瘤病毒33型 l1蛋白汉逊酵母类病毒颗粒

子宫颈病变中HPV l1蛋白和p16的表达

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临床与实验病理学杂志 2009年第6期25卷 576-579页

作者：李俐黄文斌黄悦赵有财杨小兵王劲松赵建华南京医科大学附属南京第一医院病理科南京210006

目的研究HPV l1蛋白和p16在子宫颈各种病变中的表达情况,探讨它们在子宫颈病变进展中的预测价值。方法应用免疫组化方法检测41例各种子宫颈病变(CIN1级18例、CIN2级9例、CIN3级8例和浸润性鳞状细胞癌6例)中HPV l1蛋白和p16的表达。结果H... 详细信息

目的研究HPV l1蛋白和p16在子宫颈各种病变中的表达情况,探讨它们在子宫颈病变进展中的预测价值。方法应用免疫组化方法检测41例各种子宫颈病变(CIN1级18例、CIN2级9例、CIN3级8例和浸润性鳞状细胞癌6例)中HPV l1蛋白和p16的表达。结果HPV l1蛋白在各种子宫颈病变中的阳性率为26.8%。其中HPV l1在CIN1中的阳性表达率为38.9%,CIN2为44.4%,CIN3和浸润性鳞状细胞癌均无表达。p16在各种子宫颈病变中的阳性率为68.3%,其在CIN1中的阳性表达率为38.9%,CIN2为77.8%,CIN3和浸润性鳞状细胞癌均表达阳性。100%CIN3和浸润性鳞状细胞癌为p16+/HPV l1-,而61.1%CIN1中为p16-/HPV l1+或p16-/HPV l1-。结论随着子宫颈病变的进展,HPV l1阳性表达率降低而p16阳性表达率增高。p16+/HPV l1-提示子宫颈鳞状上皮内瘤变有进展的可能,而p16-/HPV l1+和p16-/HPV l1-可能为无进展的或潜在消退的子宫颈病变。

关键词：子宫颈肿瘤上皮内瘤变 HPV l1蛋白 p16

原核表达HPV16 l1蛋白ElISA方法检测血清抗体

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中国妇幼保健 2010年第3期25卷 395-397页

作者：赵丽晶王学林许多梁作文郭恒孙树民赵淑华赵雪俭郑晶莹吉林大学基础医学院病理生理学教研室吉林长春130021 吉林大学人兽共患病教育部重点实验室吉林大学第二医院妇产科

目的:从感染人乳头瘤病毒(HPV)的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白l1基因全长,构建原核表达载体,表达并纯化蛋白用于ElISA检测。方法:根据基因序列设计一对特异引物,用PCR的方法从宫颈癌组织DNA中获得l1基因,以pet28a为载体构建表... 详细信息

目的:从感染人乳头瘤病毒(HPV)的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白l1基因全长,构建原核表达载体,表达并纯化蛋白用于ElISA检测。方法:根据基因序列设计一对特异引物,用PCR的方法从宫颈癌组织DNA中获得l1基因,以pet28a为载体构建表达质粒,IPTG诱导表达蛋白,DEAE及葡聚糖凝胶分离纯化目的蛋白,将蛋白包被平底96孔板用于ElISA检测。结果:从宫颈癌临床标本克隆到HPV16型l1蛋白编码序列,其原核表达产物纯化后可用于ElISA检测。结论:成功获得人有抗原性的HPV16l1蛋白,可用于ElISA检测。

关键词： HPV16 l1蛋白原核表达 ElISA检测

液基薄层细胞中HPV l1蛋白的表达在宫颈癌筛查中的意义

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液基薄层细胞中HPV L1蛋白的表达在宫颈癌筛查中的意义

作者：王钫昆明医学院

学位级别：硕士

目的:研究人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白(HPV l1)在宫颈液基薄层细胞学(lPT)异常涂片中的表达,并结合组织病理学结果,探讨l1蛋白的表达与宫颈病变的关系,了解其能否作为辅助诊断指标用于宫颈癌的筛查中,为宫颈癌的早期诊断提供更加特异的方... 详细信息

目的:研究人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白(HPV l1)在宫颈液基薄层细胞学(lPT)异常涂片中的表达,并结合组织病理学结果,探讨l1蛋白的表达与宫颈病变的关系,了解其能否作为辅助诊断指标用于宫颈癌的筛查中,为宫颈癌的早期诊断提供更加特异的方法。方法:选择50例lPT检查结果为非典型鳞状上皮细胞(ASC-US)以上且hc2-HPV检测结果为阳性的lPT剩余标本及10例lPT正常且hc2-HPV阴性的标本,制作液基薄片,应用免疫细胞化学S-P法和非同位素标记核酸分子杂交技术,检测涂片中的l1蛋白,并与组织病理学结果进行对照。结果:1.l1蛋白在对照组即NIlM组的细胞涂片中无表达(0/10),在ASC-US、lSIl、HSIl组的阳性表达率分别为76.2%(16/21)、68.4%(13/19)、10%(1/10)。其中,ASC-US组及lSIl组的l1蛋白阳性率显著高于NIlM组、HSIl组,差异有统计学意义,而HSIl组与NIlM组,ASC-US组与lSIl组比较差异则无统计学意义。 2.与组织病理学诊断对照:10例对照组的病检结果皆为慢性炎症,余50例患者病检结果有慢性炎症、C1N-1、CIN-2、CIN-3、SCC,l1蛋白的阳性率分别为84.6%(11/13)、81.3%(13/16)、50.0%(5/10)、14.3%(1/7)、0.0%(0/4)。其中,CIN-2以上组有6例l1蛋白表达阳性(28.6%,6/21)。慢性炎症组及CIN-1组的l1蛋白阳性率显著高于对照组、CIN-2以上组,差异有统计学意义,而CIN-2以上组与对照组,慢性炎症组与CIN-1组的阳性率比较差异则无统计学意义。结论:1.不同级别病变细胞中l1蛋白的表达存在明显差异,病变越重表达率越低。 2.l1蛋白不表达对宫颈高度病变具有一定的诊断价值,其可作为辅助诊断指标用于宫颈癌筛查中。 3.l1蛋白在一定程度上可反映HPV的感染状态。 ***标本是很好的分子生物学的研究平台,适合进行免疫细胞化学分析和核酸分子杂交技术等多种实验性研究。将l1蛋白应用于lPT涂片上将有助于检出宫颈高度病变。

关键词： l1蛋白宫颈癌宫颈上皮内瘤变免疫细胞化学

人乳头状瘤病毒l1蛋白在宫颈病变中的表达及其意义

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人乳头状瘤病毒L1蛋白在宫颈病变中的表达及其意义

作者：陈志龙郑州大学

学位级别：硕士

背景宫颈癌是威胁女性健康和生命的第二大常见的恶性肿瘤。目前已经证实持续的人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生和发展的必要因素。目前临床上采用HPV DNA检测联合宫颈细胞学检测用于宫颈癌的早期筛查,大大降低了宫颈癌的发生率。... 详细信息

背景宫颈癌是威胁女性健康和生命的第二大常见的恶性肿瘤。目前已经证实持续的人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生和发展的必要因素。目前临床上采用HPV DNA检测联合宫颈细胞学检测用于宫颈癌的早期筛查,大大降低了宫颈癌的发生率。但目前缺乏预测宫颈病变生物学行为的标志物,临床上在处理宫颈病变时予过度或不必要的治疗,这不仅危害了患者的身体健康,同时也增加了经济和精神负担。HPV l1蛋白约占衣壳蛋白的90%以上,是人体对HPV病毒免疫反应攻击的主要靶位。随着宫颈病变的进展,其表达率逐渐下降,是目前的研究热点。目的通过研究HPV l1蛋白在不同级别宫颈病变中的表达及其与HPV16/18感染及年龄等相关因素关系,探讨HPV l1蛋白在临床上的应用价值。方法选取2011年10月至2013年3月之间至郑州大学第一附属医院妇产科就诊,采用杂交捕获(或导流杂交)方法检测HPV感染患者496名,并有液基细胞学(TCT)及组织病理学检查结果。其中液基细胞学(TCT)诊断为NIlM279例,ASC-US51例,lSIl77例,ASC-H23例,HSIl66例;组织病理检查(作为金标准)诊断为慢性子宫颈炎(CC)282例,CIN193例,CIN222例,CIN383例,鳞癌16例。对此496患者的细胞学或病理切片,采用CytoReact细胞／组织人乳头瘤病毒(HPV l1)染色试剂盒检测HPV l1蛋白,分析其与宫颈病变,HPV16/18,年龄等的关系。采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,采用χ2检验,分析HPV l1蛋白的表达与HPV亚型、年龄、细胞学和组织病理学结果的关系。采用Pearson列联系数r进行计算分析相关性。检验水准为双侧α=0.05,以Pll蛋白检测阳性共112例,总阳性率22.6%(112/496)。经组织病理检查确诊为宫颈病变的患者中HPV l1蛋白的阳性率分别为CC21.99%(62/282),CIN1级34.41%(32/93),CIN2级27.27%(6/22),CIN3级13.25%(11183),SCC6.25%(1116).CC组、CIN1组、CIN2ωCIN3组及SCC组的HPV l1蛋白阳性率相比较,差异有统计学意义(χ2＝12.34,P=0.006l1蛋白的阳性率高于CC组(χ2=5.75,pl1蛋白的阳性率分别为NIlM22.58%(63/279),ASC-US17.65%(9/51),ASC-H17.39%(4/23),lSIl35.06%(22/77),HSIl13.64%(9/66).NIlM组、lSIl组、ASC-H/HSIl组及ASC-US组的HPV l1蛋白阳性率相比较,差异有统计学意义(χ2=10.81,P=0.013lISl组中HPV l1蛋白的阳性率高于NIlM组(χ2=4.98,Pl组(χ2=9.48,Pl1蛋白的阳性率高于年龄>40岁组(χ2=4.02,P=0.045l1蛋白的阳性率在年龄>40岁组与年龄≤40岁组无统计学差异(χ2=0.022,P>0.05)。4.对其中155名患者进行HPV DNA亚型检测,发现HPV l1蛋白阴性组中,16/18型HPV感染显著高于HPV ll蛋白阳性组(216.1Pl1蛋白的表达与HPV16/18感染呈负相关(r=-0.322)。结论*** l1蛋白阳性率随宫颈病变的进展逐渐降低,有望成为预测宫颈癌前病变生物学行为的标志物。2、HPV16/18感染的患者HPV l1蛋白的阳性率低于其他HPV亚型感染,HPV l1蛋白的表达与不同HPV亚型有一定的关系。3、HPV l1蛋白的阳性率在CIN2以上宫颈病变中与年龄有一定的关系。

关键词：人乳头状瘤病毒 l1蛋白宫颈上皮内瘤变预后

人乳头瘤病毒11型l1蛋白的突变分析及其类病毒颗粒疫苗的研制

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人乳头瘤病毒11型L1蛋白的突变分析及其类病毒颗粒疫苗的研制

作者：王晋厦门大学

学位级别：硕士

流行病学和相关研究证实人乳头瘤病毒(HPV)感染与尖锐湿疣、宫颈上皮瘤样增生和宫颈癌的发生关系密切。其中,HPV6、11型是尖锐湿疣的主要致病因子,大约90%的生殖器疣与HPV6和HPV11有关。预防HPV11感染的疫苗研制具有良好的社会效益及经... 详细信息

流行病学和相关研究证实人乳头瘤病毒(HPV)感染与尖锐湿疣、宫颈上皮瘤样增生和宫颈癌的发生关系密切。其中,HPV6、11型是尖锐湿疣的主要致病因子,大约90%的生殖器疣与HPV6和HPV11有关。预防HPV11感染的疫苗研制具有良好的社会效益及经济效益。研究结果表明,HPV l1能独立组装成为HPV类病毒颗粒(VlP),从而良好地再现HPV的天然中和表位,并具有较好的免疫原性,是目前预防性疫苗研究的主要目标蛋白。本研究利用原核表达系统非融合表达HPV11 l1蛋白及其突变体,研究N端序列以及关键氨基酸对HPV11 l1的表达和VlP组装效率的影响,从而获得可用于预防HPV11病毒感染的疫苗。首先,HPV11-l1蛋白N端缺失突变结果表明,N端缺失不超过16aa的突变不影响VlP的形成,但对目的蛋白的表达量有不同程度的影响,其中缺失4aa的突变体HPV11N4C-l1在大肠杆菌中的表达量较大,可用于预防性疫苗的研究。其次,分析Genebank中两株HPV11序列发现在aa364、aa453、aa501出现差异(分别为Glu和lys、Ser和Tyr、lys和Arg),实验显示两种蛋白的理化性质和VlP的组装有较大的差异。定点突变实验表明,aa453与aa501的差异并不影响蛋白的性质,但aa364对VlP的组装效率至关重要。进一步将aa364突变成为Gln、Asp、Arg、Phe、Gly和leu的实验表明,氨基酸侧链对蛋白的表达和组装有显著的影响。HPV11 l1蛋白的结构模建结果表明,aa364位于维系l1结构的重要β-折叠上,计算机突变分析提示aa364侧链参与的氢键形成以及与周围氨基酸的碰撞可能是影响VlP组装的原因。多HPV序列比对分析显示,相当于HPV11-l1 aa364的氨基酸在其它型别序列上高度保守,均为本研究所确认的Glu。最后,利用上述本研究的突变研究,选定HPV11N4C-l1(含Glu)为目的基因进行HPV11预防性疫苗的研制。本研究成功地建立了一套发酵、纯化和复性工艺,并获得达到新药临床试验要求的HPV11型疫苗。动物实验结果显示,该疫苗可诱导小鼠产生较高滴度的中和抗体,中和抗体与HPV6型存在明显的交叉反应。总之,本研究为HPV11的l1蛋白性质研究、VlP组装机理提供了结构信息,为HPV11疫苗的分子设计提供了参考,成功地研制出针对HPV11的预防性疫苗,并为HPV6和HPV11杂合疫苗的研制提供了依据。

关键词：人乳头瘤病毒11型 l1蛋白类病毒颗粒突变分析疫苗

人乳头瘤病毒31亚型l1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选

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人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选

作者：寇亚停郑州大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一类侵害粘膜和上皮组织的病毒,尤其是引发女性宫颈癌。宫颈癌是全球女性第二高发癌症,而95%以上的宫颈癌是由感染HPV引起。现已鉴定的HPV亚型有200多种,其中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV4... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一类侵害粘膜和上皮组织的病毒,尤其是引发女性宫颈癌。宫颈癌是全球女性第二高发癌症,而95%以上的宫颈癌是由感染HPV引起。现已鉴定的HPV亚型有200多种,其中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等因具有较强的致病性为高危亚型。l1蛋白作为HPV的主要衣壳蛋白,是HPV感染或接种疫苗后诱发机体产生保护性免疫反应的主要病毒抗原。本研究以大肠杆菌表达的SUMO-31 l1重组蛋白为免疫原,通过细胞融合技术制备抗HPV31 l1蛋白单克隆抗体,并以该单克隆抗体为靶分子淘选HPV31l1蛋白的模拟表位。抗HPV31 l1蛋白单克隆抗体的制备及抗原模拟表位的淘选,有助于制备抗原检测试剂并且为丰富HPV31 l1蛋白表位图谱奠定基础。将实验室保存的重组表达菌Bl21(DE3)(p E SUMO-31 l1)诱导表达,最适诱导表达条件是:IPTG终浓度为0.1 mmol/l,诱导时间为10 h,诱导温度为16℃,SUMO-31 l1重组蛋白大部分以可溶形式表达,分子量约为72 k Da。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,重组蛋白具有与天然病毒类似的血凝活性。将SUMO-31 l1免疫Balb/c小鼠后,利用细胞融合技术,获得了能分泌抗HPV31 l1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C2。腹水抗体效价为1:2.56×10,亲和常数为1.2×10l/mol。间接免疫荧光实验说明2C2与293T细胞表达的HPV6、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52和HPV58亚型l1蛋白均可发生反应。间接ElISA实验说明2C2与HPV18、HPV45、HPV53和HPV58亚型l1蛋白发生交叉反应。以单克隆抗体2C2为靶分子,从噬菌体展示12肽库淘选抗原模拟表位。三轮有效淘选后,获得了14个阳性噬菌体株,其中10个被成功测序。利用Meg Align软件进行氨基酸序列比对,虽未发现有连续三个氨基酸与HPV31 l1序列同源,但是10条多肽间具有高度的同源性,优势序列为RVTVNTETAWWY。噬菌体间接竞争ElISA实验证实,该序列为HPV31 l1蛋白的模拟表位。本研究制备了抗HPV31 l1蛋白单克隆抗体2C2,以该单克隆抗体为靶分子,淘选到了HPV31 l1蛋白的一段模拟表位:RVTVNTETAWWY。

关键词：人乳头瘤病毒31亚型 l1蛋白单克隆抗体模拟表位