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基于同源建模和定点突变技术研究嗜热型l-阿拉伯糖异构酶与D-半乳糖的亲和作用

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催化学报 2012年第10期33卷 1717-1723页

作者：李贵祥徐铮李莎徐虹南京工业大学食品与轻工学院材料化学工程国家重点实验室江苏南京210009

通过同源建模分析选取对lactobacillus fermentum CGMCC2921来源的l-阿拉伯糖异构酶(简称l-AI酶)催化D-半乳糖生产D-塔格糖起重要作用的氨基酸位点进行突变,发现当Q16,M311,K423和Q438位点的氨基酸突变为丙氨酸时,突变酶Km值降低,其中... 详细信息

通过同源建模分析选取对lactobacillus fermentum CGMCC2921来源的l-阿拉伯糖异构酶(简称l-AI酶)催化D-半乳糖生产D-塔格糖起重要作用的氨基酸位点进行突变,发现当Q16,M311,K423和Q438位点的氨基酸突变为丙氨酸时,突变酶Km值降低,其中突变酶M311A降至本体的51.6%,对D-半乳糖的转化率提高了18.7%.当K423位点的氨基酸残基分别突变为丙氨酸、天冬酰胺或精氨酸时,突变酶与底物的亲和力以及D-半乳糖的转化率随着423位点突变氨基酸侧链长度的增加而降低.运用计算机分子模拟技术分析表明,当M311位点氨基酸突变为丙氨酸以后,催化位点氨基酸残基与底物D-半乳糖之间的氢键作用增强,导致与底物亲和力增大,从而提高了酶活力.

关键词： l-阿拉伯糖异构酶 D-塔格糖发酵乳杆菌同源建模定点突变

l-阿拉伯糖异构酶的酶学性质及酶法制备塔格糖研究

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L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质及酶法制备塔格糖研究

作者：翁玮慧江南大学

学位级别：硕士

塔格糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖,属于稀少糖的一种,稀少糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖。塔格糖是果糖的“差向异构体”,在分子水平上,除了第四个碳原子上的羟基和氢基团倒置外,D-塔格糖与D-果糖的结构是一样的... 详细信息

塔格糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖,属于稀少糖的一种,稀少糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖。塔格糖是果糖的“差向异构体”,在分子水平上,除了第四个碳原子上的羟基和氢基团倒置外,D-塔格糖与D-果糖的结构是一样的。塔格糖的甜度是蔗糖的92%,甜味与蔗糖相似,不产生不良风味和后味,是一种很好的甜味剂。经过测试发现塔格糖没有毒性和致癌效应,在食品工业上可以安全使用。与蔗糖相比塔格糖具有许多优点:低热量,塔格糖在体内只有20%被小肠吸收;同时具有抗龋齿、降血糖,改善肠道菌群及良好的理化性质等。塔格糖作为一种具有保健功能的新型甜味剂,将会拥有广阔的市场前景。考虑到实验中数据的采集和处理,需要建立一种简便快速,有效地测定酶活力的方法。根据Dische所介绍的半胱氨酸-咔唑法,对塔格糖含量的测定条件进行了研究,确定了简便快捷,重现性好的测定方法。本实验室筛选得到的一株乳酸菌lactobacillus SK1.002能产l-阿拉伯糖异构酶,本文对SK1.002菌株的发酵条件进行了优化,确定发酵优化条件为(g/l):麦芽糊精28,酵母膏10,玉米粉浆22,无水乙酸钠10,K3PO4 0.2, NaCl 0.01, FeSO4·7H2O 0.01, MgSO4·7H2O 0.2, MnSO4·2H2O 0.05, l-阿拉伯糖2.5。发酵初始pH 8.4,培养温度37℃,接种量3%,培养时间12h。在此发酵条件下,酶活达到了7.28 U/ml。 l-阿拉伯糖异构酶为胞内酶,对lactobacillus SK1.002所产的l-阿拉伯糖异构酶进行粗酶提取及初步纯化。细胞超声波破碎10min(冰浴,功率200w),离心除去菌体碎片(9600rpm,10min),上清液即为粗酶液。粗酶液先后通过硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、得到初步纯化的l-阿拉伯糖异构酶。对初步纯化的l-阿拉伯糖异构酶的酶学性质进行了研究。l-阿拉伯糖异构酶粗酶的最适反应温度和pH分别为60℃和7.0;在pH4.0.0的范围内和300℃下具有较好的稳定性。li+、Mn2+、Mg2+、Fe2+等离子对l-阿拉伯糖异构酶有激活作用,其中Mn2+的激活作用尤其显著,而Ba2+、Zn2+、Cu2+、SDS对l-阿拉伯糖异构酶有抑制作用,其中Ba2+、Zn2+的抑制作用显著,使酶完全失活。转化半乳糖的Km为1193.93mmol/l,Vmax为13.51μg/min。本文还对l-阿拉伯糖异构酶生物合成塔格糖的工艺进行了初步探讨。用l-阿拉伯糖异构酶的粗酶、10%和40%的湿重细胞转化生成塔格糖,最适半乳糖浓度0.83mol/l,40%的湿重细胞反应72h后,转化率达到38.91%。最后通过红外光谱测定,证明l-阿拉伯糖异构酶转化半乳糖生成的产物为塔格糖。

关键词：乳酸菌 l-阿拉伯糖异构酶塔格糖

l-阿拉伯糖异构酶酶学性质表征及乳清粉生物合成D-塔格糖的研究

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L-阿拉伯糖异构酶酶学性质表征及乳清粉生物合成D-塔格糖的研究

作者：张国艳江苏大学

学位级别：硕士

D-塔格糖(D-tagatose)是自然界中天然存在的一种稀有糖,甜度为蔗糖的92%,但热量不到蔗糖的1/3,是一种新型的低热量甜味剂。D-塔格糖具备预防肥胖、降血糖、改善肠道菌群和抗龋齿等重要的生理功能,在食品、医药等领域应用广泛。生物法制... 详细信息

D-塔格糖(D-tagatose)是自然界中天然存在的一种稀有糖,甜度为蔗糖的92%,但热量不到蔗糖的1/3,是一种新型的低热量甜味剂。D-塔格糖具备预防肥胖、降血糖、改善肠道菌群和抗龋齿等重要的生理功能,在食品、医药等领域应用广泛。生物法制备D-塔格糖因环境友好、催化效率高、条件温和、副产物少等优势备受关注。目前,利用l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase,l-AI)转化D-半乳糖合成D-塔格糖的研究已被大量报道,但底物不够低廉、转化效率不高、l-AI酶学性质不适宜等因素仍制约着D-塔格糖生物合成的工业化进程。因此,开发新型l-AI及探索如何利用廉价乳清粉高效制备D-塔格糖有望为D-塔格糖的生物合成奠定基础。有鉴于此,本研究开展了如下工作:(1)以泡菜汁和婴儿粪便为样品,通过菌种富集、初筛及半胱氨酸-咔唑法复筛,再利用生理生化及分子生物学鉴定的方法,最终从泡菜汁中分别获得了一株lactobacillus salivarius CY.2和一株lactobacillus plantarum CY.6,从婴儿粪便中获得了一株Bifidobacterium adolescentis HY.3。(2)克隆了*** HY.3的l-AI(BAAI)编码基因araA,大小为1515bp,构建了重组菌*** Bl21/pANY1-Ba-araA。IPTG诱导该重组菌表达了BAAI,经包涵体溶解及复性试剂盒复性后获得了具有生物学活性的BAAI,其蛋白大小为55kDa,比活力为24.47 U/mg。对BAAI进行生物信息学分析,首先,构建了BAAI的进化树,结果表明其与Bifidobacterium longum的l-AI具有高保守性;其次,进行多序列比对分析得出BAAI与其他l-AI序列间的氨基酸保守关系,BAAI酶活性中心关键氨基酸为Glu308、His352、Glu335和His452;最后,构建了BAAI的三维结构模型并分析了关键氨基酸的作用方向。BAAI的最适温度为55℃,最适pH为6.5,该酶具有良好的稳定性;具备最佳激活作用的离子为6mM的Mn;底物特异性研究表明BAAI的最适底物为D-半乳糖,并通过底物-蛋白分子模拟对接从分子层面证实了D-半乳糖与BAAI的对接模型存在最多的氢键;D-半乳糖为底物时,BAAI的K、V和K/K分别为22.4 mM、489U/mg和9.3mMmin;而以l-阿拉伯糖为底物时,分别为40.2 mM,275.1 U/mg和8.6 mMmin。最后,初步测定了BAAI对D-半乳糖的转化率为56.7%。(3)从*** CY.6中克隆了l-AI(lPAI)的编码基因araA,大小为1425 bp,构建了重组菌*** Bl21/pANY1-lp-araA并表达了lPAI,蛋白大小约为55kDa。制备了重组菌的静息细胞,联合β-半乳糖苷酶以廉价原料乳清粉为底物制备D-塔格糖。首先,基于100%(Separate hydrolysis and biotransformation,SHB)、0%(Simultaneous saccharification and biotransformation,SSB)和50%(Semi-SSB)的乳糖水解设计了三种不同的D-塔格糖合成方案,研究结果表明,SSB条件下D-塔格糖的产量最高,为Semi-SSB和SHB的两倍。采用单因素法优化了SSB的反应条件参数,最适温度为50℃,最适pH为6.5,最适Mn浓度为5mM,最佳反应时间为48 h,最适乳糖浓度为140 g/l,最佳全细胞菌体浓度为20g/l。在以上优化条件下进行了第一阶段48 h的反应,此时D-塔格糖的浓度为34.4 g/l,乳糖到D-塔格糖的转化率为24.2%,D-半乳糖到D-塔格糖的转化率为52.4%。以第一阶段反应结束后的溶液为底物溶液,在相同条件下进行了第二阶段48 h的反应,结果表明,D-塔格糖的浓度从34.4 g/l提高到了51.5 g/l,乳糖转化率从24.2%提高到37%,D-半乳糖转化率从52.4%提高到了74%。

关键词： D-塔格糖 l-阿拉伯糖异构酶生物信息学乳清粉生物合成

l-阿拉伯糖异构酶在枯草芽孢杆菌中的芽孢表面展示及酶学性质研究

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L-阿拉伯糖异构酶在枯草芽孢杆菌中的芽孢表面展示及酶学性质研究

作者：朱婧斐江苏大学

学位级别：硕士

D-塔格糖作为低热量甜味剂,代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域,并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等功效。而l-阿拉伯糖异构酶(l-AI)是微生物体内的一种催化醛酮糖间反应的异构酶,可以转化D... 详细信息

D-塔格糖作为低热量甜味剂,代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域,并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等功效。而l-阿拉伯糖异构酶(l-AI)是微生物体内的一种催化醛酮糖间反应的异构酶,可以转化D-半乳糖生成D-塔格糖。化学法生产D-塔格糖存在产物纯化复杂、废物处理成本高等问题,因而近来利用l-AI对D-塔格糖的生物法制备以实现工业化生产成为研究的热点。枯草芽孢杆菌作为非致病性的基因工程受体菌,在表达外源蛋白方面已日趋成熟。依靠枯草芽孢杆菌在营养缺乏或环境胁迫下产生的芽孢的独特抗逆性,通过芽孢表面展示技术将具有催化活性的外源蛋白酶展示在芽孢表面,可以大大增加酶制剂的应用条件和范围。因此本研究致力于将乳酸菌来源的l-AI展示在芽孢表面,诱导表达具有高稳定性和催化活性的重组芽孢,并对重组酶的酶学特征及其转化D-半乳糖的情况进行分析。本课题的研究内容和结果主要包括以下几个方面:首先,从泡菜样品中筛选得到具有产酸能力且革兰氏染色鉴定为阳性的乳酸菌,然后利用半胱氨酸-咔唑法初筛到18株能利用D-半乳糖产生D-塔格糖的菌株,再用TlC法对表达l-阿拉伯糖异构酶(l-AI)转化生成D-塔格糖的菌株进行定性和初步定量分析,得到了4株具有明显特征的菌株。通过形态特征和生理生化鉴定以及16S rDNA序列同源性分析,得到了两株具有l-阿拉伯糖异构酶活性且能产生塔格糖的乳酸菌:lactobacillus plantarum和lactobacillus brevis,将其分别命名为lactobacillus plantarum PC5和lactobacillus brevis PC14。通过比较分析,选取*** PC14为模板,进一步研究l-阿拉伯糖异构酶的性质。利用l-阿拉伯糖异构酶的编码基因已知序列设计引物,从筛选到的***基因组中克隆得到1425 bp的araA基因片段,利用质粒载体pSE380构建重组大肠杆菌菌JM109/pSE-araA,经IPTG诱导后成功表达了重组蛋白,特征条带大小约为55 kDa。采用半胱氨酸-咔唑法,以D-半乳糖为底物,对重组l-阿拉伯糖异构酶的酶活力进行测定得到酶反应的最适温度为65℃,最适pH值约为6.8,对D-半乳糖的Km及Vmax值分别为77.3 mmol/l和6.0μmol/(l·min),D-半乳糖的转化率为53%。从Bacillus subtilis 168基因组中扩增出芽孢表面展示蛋白CotG的编码基因cotG,与araA同时插入到质粒pHS中构建融合质粒pHS/cotG-araA及*** DB403基因工程菌B.s/cotG-araA,诱导制备芽孢悬液后经SDS-PAGE和Western Blot分析表明,l-阿拉伯糖异构酶与CotG实现了融合表达,l-阿拉伯糖异构酶成功展示到了芽孢表面,分子量约75 kDa。重组酶的最适反应温度为65℃,最适pH值为6.8,与***内的重组酶特性一致,但前者表现出了更好的热稳定性和pH稳定性。芽孢表面展示的l-AI对D-半乳糖的Km及Vmax值分别为48.0 mmol/l和9.7μmol/(l·min),转化率达62%。重组芽孢回收利用试验表明,经过4次的回收后,l-阿拉伯糖异构酶的酶活力并没有明显的减低。

关键词： D-塔格糖 D-半乳糖 l-阿拉伯糖异构酶枯草芽孢杆菌芽孢表面展示

l-阿拉伯糖异构酶的克隆表达及酶学性质研究

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L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达及酶学性质研究

作者：李彦君天津科技大学

学位级别：硕士

D-塔格糖是一种在自然界存在极少的功能性已酮糖,可以应用于食品、医药、保健及化妆品等多种领域。本文研究利用微生物酶生物转化D-半乳糖为D-塔格糖,为实现从廉价糖原料到稀少糖的转化奠定基础。 1.菌种筛选：实验从土壤中分离出一种... 详细信息

D-塔格糖是一种在自然界存在极少的功能性已酮糖,可以应用于食品、医药、保健及化妆品等多种领域。本文研究利用微生物酶生物转化D-半乳糖为D-塔格糖,为实现从廉价糖原料到稀少糖的转化奠定基础。 1.菌种筛选：实验从土壤中分离出一种可产生l-阿拉伯糖异构酶转化D-半乳糖生产D-塔格糖的嗜热菌株No.6。经菌体及菌落形态、生理生化特性以及16S rDNA进化树分析等方法,将其鉴定为Anoxybacillus flavithermus。实验表明该菌株有一个广泛的生长温度(45-70℃)和pH(5.5-9.5),最适温度55℃和最适pH为8.5。 2.克隆表达：将No.6菌株编码l-阿拉伯糖异构酶的基因片段克隆到E. coli Bl21(DE3)中进行诱导表达。经SDS-PAGE分析检测重组l-阿拉伯糖异构酶蛋白分子量约为56.3kDa,所表达目的蛋白占菌体总蛋白的22.5%。 3.蛋白纯化：将诱导好的菌株用超声波细胞破碎仪破碎、4℃离心12000rpm离心10min后收集上清液,80℃热处理10min以去除宿主蛋白,12000rpm离心10min收集上清。由于表达出的蛋白质带有6×His表达标签,可进一步利用Ni-NTA进行亲和柱层析来提纯表达出的蛋白质。初步纯化结果显示纯酶得率可以达到30mg/l,纯度可达到90%以上,并检测其酶活为26.4U/mg。 4.酶学性质研究：结果表明重组的l-阿拉伯糖异构酶是一个极端嗜热嗜碱的异构酶,最适温度和pH分别为95℃和9.5-10.5;其活性并不依赖金属离子;该酶还对D-半乳糖具有较高的底物特异;转化D-半乳糖的Vmax为454.55μmol/l·min,Km为26.81mM;硼砂可以提高重组酶的催化效率,使kcat/Km提高一倍。 5.酶法合成D-塔格糖的研究：该酶在最适温度95℃、pH9.5的硼砂缓冲液中反应1h,D-半乳糖转化生成D-塔格糖的转化率可以达到60%以上。

关键词： D-塔格糖 l-阿拉伯糖异构酶 Anoxybacillus flavithermus 嗜热性嗜碱性

生物转化生产D-塔格糖的食品级菌种选育及l-阿拉伯糖异构酶的克隆表达

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生物工程学报 2012年第5期28卷 592-601页

作者：门燕朱玥明管于平张同存何森健孙媛霞天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase,l-AI)是一种可以催化D-半乳糖为D-塔格糖的胞内异构化酶。随着塔格糖在食品工业中越来越广泛的应用,能够将半乳糖转化为塔格糖的食品级微生物以及食品级来源的l-AI受到更大的关注。文中从各种... 详细信息

l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase,l-AI)是一种可以催化D-半乳糖为D-塔格糖的胞内异构化酶。随着塔格糖在食品工业中越来越广泛的应用,能够将半乳糖转化为塔格糖的食品级微生物以及食品级来源的l-AI受到更大的关注。文中从各种酸奶制品、泡菜及其他一些食品中采集不同的样品,筛选出1株具有l-AI酶活的食品级菌株,经过生理生化鉴定以及16S rDNA序列测定,确定该菌株为戊糖片球菌,命名为Pediococcus pentosaceus PC-5。以该菌基因组为模板,克隆l-AI基因,并在大肠杆菌Bl21成功地异源表达。表达产物经粗提取后,在40℃下加入Mn2+,使D-半乳糖转化为D-塔格糖的转化率为33%。

关键词： l-阿拉伯糖异构酶 D-塔格糖食品级微生物

发酵乳杆菌来源l-阿拉伯糖异构酶理性设计及在D-塔格糖生产中的应用

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生物工程学报 2023年第3期39卷 1107-1118页

作者：李娟吴敬陈晟夏伟江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学教育部食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122

l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase,l-AI)是D-半乳糖异构化生成D-塔格糖的关键酶。为提高l-阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的活性及在生物转化中的转化率,本研究对发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)CGMCC2921来源的l-阿拉伯糖异构... 详细信息

l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase,l-AI)是D-半乳糖异构化生成D-塔格糖的关键酶。为提高l-阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的活性及在生物转化中的转化率,本研究对发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)CGMCC2921来源的l-阿拉伯糖异构酶进行重组表达和生物转化应用,并对其底物结合口袋进行理性设计以提高酶对D-半乳糖亲和力和催化活性。结果显示,突变体F279I对D-半乳糖的转化率提高至野生型酶的1.4倍,进一步叠加获得的双突变体M185A/F279I的Km和kcat分别为530.8mmol/l与19.9s-1,底物亲和力显著提高,催化效率提高至野生型酶的8.2倍。以400 g/l乳糖为底物时,突变酶M185A/F279I转化率高达22.8%。本研究在乳糖高值化生产塔格糖方面具有重要的应用价值。

关键词： l-阿拉伯糖异构酶理性设计 D-半乳糖 D-塔格糖转化率

微生物来源的l-阿拉伯糖异构酶的研究进展及应用前景

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微生物学通报 2008年第10期35卷 1626-1632页

作者：程丽芳沐万孟张涛江波江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

l-阿拉伯糖异构酶(l-AI)能分别催化l-阿拉伯糖和D-半乳糖异构为l-核酮糖和D-塔格糖,它是目前生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。近年来,l-AI的结构已被揭晓,其基因已获得克隆、测序和过量表达,经过蛋白质工程改造的l-AI将... 详细信息

l-阿拉伯糖异构酶(l-AI)能分别催化l-阿拉伯糖和D-半乳糖异构为l-核酮糖和D-塔格糖,它是目前生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。近年来,l-AI的结构已被揭晓,其基因已获得克隆、测序和过量表达,经过蛋白质工程改造的l-AI将是未来工业化生产D-塔格糖的主要用酶。本文综述了近年来国外对l-AI的结构与功能、催化机理、酶学性质及应用于D-塔格糖生产方面的研究状况,并展望了其发展前景。

关键词： l-阿拉伯糖异构酶 D-塔格糖结构与功能酶学性质基因工程

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D-塔格糖与l-阿拉伯糖异构酶的研究进展

食品与发酵工业 2007年第6期33卷 84-90页

作者：沐万孟张涛江波张华江南大学食品科学与安全教育部重点实验室江苏无锡214036

D-塔格糖是一种天然的低能量填充型甜味剂,并具有抑制高血糖、改善肠道菌群和不致龋齿等多种生理功效。D-塔格糖是一种稀有糖,因此通常利用化学转化或生物转化方法进行大量生产。l-阿拉伯糖异构酶是生物法工业化生产D-塔格糖的有效酶。... 详细信息

D-塔格糖是一种天然的低能量填充型甜味剂,并具有抑制高血糖、改善肠道菌群和不致龋齿等多种生理功效。D-塔格糖是一种稀有糖,因此通常利用化学转化或生物转化方法进行大量生产。l-阿拉伯糖异构酶是生物法工业化生产D-塔格糖的有效酶。文中对D-塔格糖的性质、功能及利用l-阿拉伯糖异构酶生产D-塔格糖的研究新进展进行了综述。

关键词： D-塔格糖甜味剂稀有糖 l-阿拉伯糖异构酶