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l-谷氨酸氧化酶与CBD的融合表达及其在微晶纤维素上固定化分析

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生物工程学报 2016年第10期32卷 1348-1361页

作者：宋辉张文宇王鹏举谭焕波苏文成赵树欣邹培建天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308

酶的固定化作为一种重要的技术,已在生物催化领域得到了广泛的应用。现将来源于普拉特链霉菌3304(Streptomyces platensis NTU3304)产生的胞外l-谷氨酸氧化酶(l-glutamate oxidase,Gox)基因gox融合到来源于粪碱纤维单胞菌Cellulomonas f... 详细信息

酶的固定化作为一种重要的技术,已在生物催化领域得到了广泛的应用。现将来源于普拉特链霉菌3304(Streptomyces platensis NTU3304)产生的胞外l-谷氨酸氧化酶(l-glutamate oxidase,Gox)基因gox融合到来源于粪碱纤维单胞菌Cellulomonas fimi的纤维素结合域(CBDcex)的基因上,构建表达载体p ETM10-Gox-CBD,并在大肠杆菌中表达。通过蛋白纯化获得融合蛋白,并命名为Gox-CBD。利用CBD对微晶纤维素特异性吸附的特性将其固定在微晶纤维素上,并对固定化酶的制备条件、结合量、酶学性质及其微晶纤维素结合稳定性等进行了研究。在4℃条件下结合约1 h,融合蛋白Gox-CBD结合在纤维素上的结合量即可达到9.0 mg/g。通过对重组型、融合表达游离的以及固定化在微晶纤维素上的谷氨酸氧化酶的酶学性质进行比较发现,固定化酶的比酶活有所降低;但固定化酶的热稳定性相对于游离酶有了很大的提高,在60℃孵育30 min后还保留有约70%的活性,而游离的重组Gox在相同条件下几乎完全失去活性。当固定化结合蛋白在p H5 mmol/l的Na Cl条件下可以牢固结合。并且可以通过一步纯化方法固定化融合蛋白Gox-CBD于微晶纤维素上。因此,l-谷氨酸氧化酶与纤维素结合域融合表达的研究为蛋白的纯化及酶的固定化提供了一种新策略。

关键词： l-谷氨酸氧化酶纤维素结合域固定化

l-谷氨酸氧化酶的克隆表达、纯化及酶学性质研究

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中国生物工程杂志 2013年第6期33卷 38-44页

作者：卢婵郑璞孙志浩江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

为提高微生物产l-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的l-谷氨酸氧化酶基因(lGOX)与表达载体pET28a连接,导入*** Bl21(DE3),实现lGOX的高效表达。采用HisTrapTMFF亲和层析柱对重组l-谷氨酸氧化酶进行纯化,并对纯酶的酶学性质... 详细信息

为提高微生物产l-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的l-谷氨酸氧化酶基因(lGOX)与表达载体pET28a连接,导入*** Bl21(DE3),实现lGOX的高效表达。采用HisTrapTMFF亲和层析柱对重组l-谷氨酸氧化酶进行纯化,并对纯酶的酶学性质进行了研究。结果表明:在IPTG终浓度为0.4 mmol/l下,30℃诱导6 h,可以获得比酶活为1.1 U/mg的粗酶液;重组酶的最适反应温度和pH分别为37℃和5.0;Km值为2.12 mmol/l,Vmax为1.06μmol/***,对l-谷氨酸具有专一性;具有良好的应用前景。

关键词： l-谷氨酸氧化酶克隆表达酶学性质

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l-谷氨酸氧化酶的研究进展

中国酿造 2017年第10期36卷 9-12页

作者：于爽迟乃玉张庆芳大连大学生命科学与技术学院辽宁大连116622 辽宁省海洋微生物工程技术研究中心辽宁大连116622

l-谷氨酸氧化酶是一种潜在的十分有用的工具酶,其辅酶是黄素腺嘌呤二核苷酸,是一种黄素蛋白酶类。以l-谷氨酸为底物,将其降解为过氧化氢、氨和α-酮戊二酸,具有高度底物特异性。该文从l-谷氨酸氧化酶的来源、应用、克隆表达与分离纯化... 详细信息

l-谷氨酸氧化酶是一种潜在的十分有用的工具酶,其辅酶是黄素腺嘌呤二核苷酸,是一种黄素蛋白酶类。以l-谷氨酸为底物,将其降解为过氧化氢、氨和α-酮戊二酸,具有高度底物特异性。该文从l-谷氨酸氧化酶的来源、应用、克隆表达与分离纯化进行了阐述,并对其研究前景进行了展望。

关键词： l-谷氨酸氧化酶来源应用克隆表达纯化研究前景

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l-谷氨酸氧化酶发酵条件及分离纯化的研究

L-谷氨酸氧化酶发酵条件及分离纯化的研究

作者：李玲山东轻工业学院

学位级别：硕士

l-谷氨酸氧化酶(l-glutamate oxidise，简称GlOD)是80年代初开始发现的一种新酶，最早从蛇的毒液、鼠的肾脏、无脊椎动物和微生物等生物体中分离得到。它是以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶类，对l-谷氨酸生成HO、氨和α-... 详细信息

l-谷氨酸氧化酶(l-glutamate oxidise，简称GlOD)是80年代初开始发现的一种新酶，最早从蛇的毒液、鼠的肾脏、无脊椎动物和微生物等生物体中分离得到。它是以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶类，对l-谷氨酸生成HO、氨和α-酮戊二酸有很好的专一性，食品、医药、发酵等领域都有广泛的应用，成为一种非常实用的工具酶。但是目前，国内对该酶的研究只是局限于产酶菌种发酵条件的优化和对GlOD粗品的生产，对GlOD纯品的制备非常少见，我们使用的GlOD纯品主要是由国外几家公司生产，价格非常昂贵，且偶有供货不及时的现象，很大程度上限制了该酶的广泛使用，因此GlOD纯品的国产化势在必行。本研究选用山东省科学院生物研究所保存的华美链霉菌(Streptomycessplendens4.666)菌株，经过复壮、活化，筛选出一株表现出高于其他菌株的产酶能力的菌株，并对其形态特性、生理生化特性进行了检测，作为GlOD的生产菌株进行下续的实验。为进一步提高该菌株生物活性的利用价值，该研究对菌株的生长与产酶条件进行了优化。分别利用响应面法进行了培养基组成优化和单因素试验法进行了培养条件优化。实验得到最佳培养基组成：3.0%葡萄糖，3.2%蔗糖，2.2%玉米浆，1.0%硫酸铵，1.0%谷氨酸钠，0.05%MgCl，0.05%KCl，0.05%NaHPO，每个摇瓶加3%固体粉状CaCO;最适培养条件：培养基初始pH值为6.7，装液量30ml，转化温度为28℃，转化时间48h，接种量3.0%，经验证：优化后GlOD产量明显提高，由9.56g/l提高到19.1g/l，是初始GlOD产量的2倍。利用Streptomyces splendens4.666发酵生成GlOD，设计出能达到较高纯度的GlOD的分离纯化路线。发酵液经过高速冷冻离心、硫酸铵分级沉淀、SephadexG-25脱盐、MonoQ离子交换、Superdex G-200凝胶层析及冷冻干燥等步骤得到纯化的GlOD。纯化后的GlOD比活力为176U/mg，纯化收率为12.95%，纯化倍数926倍。纯化后的GlOD经SDS-PAGE电泳为单一条带。SDS-PAGE和Superdex G-200凝胶层析分析显示为约140kDa的单链蛋白，说明该酶经过FPlC快速蛋白分离纯化系统，去除了大部分多糖杂质，纯度检测达到98.67%。最后，对GlOD的酶学特性和应用进行了研究。结果表明，该GlOD的pH稳定范围为0～50℃，最适pH和最适温度分别为pH7.0和50℃，该酶催化l-谷氨酸的米氏常数Km为2.1×10mol/l，大多数金属离子如Na、K、Mg对GlOD对酶活几乎没有影响，微量的Cu使酶活降低近50%，而Hg、Ag则显著抑制了酶的活性。我们将浓缩脱盐后的酶液冻干，固定化制作成酶膜，应用于生物传感器中，并且与国外GlOD制成的酶膜活性相比较。因此，本文只是为我国生产商品化的GlOD做些理论上及实践上的初步探索，相比于国际化的商品酶，仍有较大距离。实际研究中，由于实验条件的限制，未能对该酶的部分氨基酸序列进行分析，另外，该菌株的中试生产研究也有待探索。对GlOD纯品的探索研究，既能为生物传感器开辟一个新的应用领域，又能降低耗材成本，节约外汇，促进生物传感分析仪的推广应用，具有极高的投资价值和市场潜力。

关键词：华美链霉菌 l-谷氨酸氧化酶响应面设计分离纯化酶学特性

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l-谷氨酸氧化酶的制备及固定化研究

L-谷氨酸氧化酶的制备及固定化研究

作者：宋辉天津科技大学

学位级别：硕士

l-谷氨酸氧化酶(EC 1.***.3.11 Gox)是以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的一种黄素酶,它能特异的催化立体异构的l-谷氨酸氧化脱氨基,生成α-酮戊二酸、H202和氨。而纤维素结合域(CBD)能特异的结合在纤维素载体上,对纤维素没有催化作用。... 详细信息

l-谷氨酸氧化酶(EC 1.***.3.11 Gox)是以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的一种黄素酶,它能特异的催化立体异构的l-谷氨酸氧化脱氨基,生成α-酮戊二酸、H202和氨。而纤维素结合域(CBD)能特异的结合在纤维素载体上,对纤维素没有催化作用。作为一种大量存在,并具有潜在应用的可再生能源,它具有结合量大、结合特异性强等特性。通过融合蛋白表达,将目的蛋白固定化纤维素基质上,从而发挥融合蛋白的功能及作用。本论文以现有的谷氨酸氧化酶基因进行了克隆、异源表达、纯化和相关酶学特性测定,并对Gox的固定化进行了初步的探索研究。本论文通过构建表达载体pET-24a(+)-Gox和pETM-10-Gox-CBD,经大肠杆菌诱导表达条件优化获得目的蛋白重组蛋白l-谷氨酸氧化酶(Gox)和l-谷氨酸氧化酶与纤维素结合域的融合蛋白(Gox-CBD)。在酶活性研究中发现,Gox在大肠杆菌异源表达时,可形成足够量的辅基FAD,而且辅基在分离过程中不易脱落,不需要额外添加。在4℃条件下结合4h,融合蛋白Gox-CBD充分结合吸附到结晶纤维素上的量约为9.0 mg/g。对异源表达的Gox、游离的Gox-CBD和固定化的Gox-CBD进行酶活特性测定,并进行了比较发现,固定化酶Gox-CBD相对于重组蛋白Gox的比酶活略有降低,但在热稳定性上固定化酶比游离酶提高了很多,在60℃放置30 min后还保留有75%的活性,而游离酶则完全丧失了活性。与此同时,将破碎的大肠杆菌离心上清液直接进行一步纯化Gox-CBD的纯化实验操作,SDS-PAGE验证显示,可以获得比较纯的Gox-CBD。Gox作为黄素酶的一种,它的应用范围较为广泛。Gox的异源表达表明:可以通过大肠杆菌的表达系统表达有活性的酶蛋白。通过一步纯化操作,可以将融合有纤维素结合域的l-谷氨酸氧化酶结合到微晶纤维素上,其操作方便,特异性强,并且经济实惠,与重组l-谷氨酸氧化酶相比,其比酶活无明显变化。通过融合表达Gox的方法,并对固定到纤维素上的l-谷氨酸氧化酶酶学特性进行了初步的探索,为后续的生物传感器的应用、α-酮酸的制备等方面提供了理论基础。

关键词：纤维素结合域 l-谷氨酸氧化酶固定化

l-谷氨酸氧化酶菌株的选育及基因的克隆与表达研究

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L-谷氨酸氧化酶菌株的选育及基因的克隆与表达研究

作者：卢婵江南大学

学位级别：硕士

l-谷氨酸氧化酶(EC1.***.3.11，lGOX)是以FAD为辅酶的一种l-氨基酸氧化酶，广泛应用于测定食品、发酵和医药行业l-谷氨酸的含量及其有关的偶联反应。从二十世纪八十年代开展对l-谷氨酸氧化酶的研究至今，国内外所报道的生产l-谷氨酸氧化... 详细信息

l-谷氨酸氧化酶(EC1.***.3.11，lGOX)是以FAD为辅酶的一种l-氨基酸氧化酶，广泛应用于测定食品、发酵和医药行业l-谷氨酸的含量及其有关的偶联反应。从二十世纪八十年代开展对l-谷氨酸氧化酶的研究至今，国内外所报道的生产l-谷氨酸氧化酶的菌株不多，其产酶能力普遍较低。为获得优良产l-谷氨酸氧化酶的菌株，本论文主要进行了以下研究：产酶菌株的筛选与鉴定：对土壤进行富集处理，采用4-氨基安替吡啉/苯酚显色反应的方法，筛选出一株产l-谷氨酸氧化酶的菌株Str-6。从形态、培养特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，将该菌株Str-6鉴定为山丘链霉菌。其16S rDNA序列在Genbank的登记号为JX050226。其发酵产l-谷氨酸氧化酶酶活为1.62×10U/ml。产酶菌株的诱变与产酶培养基的优化：采用硫酸二乙酯和紫外对菌株进行诱变，从突变株中选育出了一株产酶性能较稳定的菌株Str-U8，其l-谷氨酸氧化酶酶活为1.98×10U/ml，为出发菌株的1.2倍。对产酶培养基碳氮源、诱导剂和初始pH进行了优化，得出最佳的产酶培养基为：葡萄糖2.5%、玉米浆0.8%、(NH)SO0.6%、CaCO3%、CaCl0.3%、MgCl·6HO0.1%、KCl0.1%和l-谷氨酸0.9%，pH6.5。在该条件下，菌株Str-U8的l-谷氨酸氧化酶酶活提升至3.40×10U/ml，为出发菌株的2.1倍。该菌l-谷氨酸氧化酶为胞外酶，属于生长同步型。粗酶的最适反应温度为35℃、最适反应pH为6.0，除作用于l-谷氨酸外，对天门冬酰胺和谷氨酰胺有微弱反应。 l-谷氨酸氧化酶基因的克隆、表达：将来自Streptomyces sp. X-119-6的l-谷氨酸氧化酶基因与表达载体pET28a连接，导入大肠杆菌Bl21(DE3)中进行表达。在IPTG浓度为0.4mmol/l、诱导时间为6h、诱导温度为30℃的条件下，l-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.1U/mg。在3l发酵罐上，重组菌Bl21(DE3)/pET28a-lGOX产l-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.61U/mg。重组l-谷氨酸氧化酶的酶学性质：采用HisTrapFF亲和层析的方法，获得单一的l-谷氨酸氧化酶蛋白条带，纯化后l-谷氨酸氧化酶比酶活为2.1U/mg,蛋白纯化倍数为1.9倍。该酶的最适反应温度为37℃、最适反应pH为5.0，除作用于l-谷氨酸外，只对谷氨酰胺有微弱酶活。在最适反应条件下，对l-谷氨酸的K值为2.12mmol/l，V为1.0645μmol/min·mg。

关键词： l-谷氨酸氧化酶筛选克隆酶学性质

白丝北里孢菌l-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析

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食品科学 2018年第2期39卷 58-65页

作者：陈稳李由然顾正华丁重阳张梁石贵阳江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室生物工程学院江苏无锡214122

为实现从l-谷氨酸到α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)的高效生物转化,将来源于白丝北里孢菌(Kitasatospora setae KM-6054)的l-谷氨酸氧化酶(l-glutamate oxidase,lGOX)在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源表达,并研究其酶学特性。根据lGOX的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成lGOX全基因序列,并通过pET28a(+)/DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)终浓度为0.1 mmol/l,20℃诱导18 h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10 U/m l。亲和层析获得酶比活力为45.98 U/mg纯酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小约为70 kDa。酶学性质研究表明:其最适反应温度和pH值分别为40℃和6.0;K_m值为1.23 mmol/l,V_(max)值为76.24μmol/(min·mg),l-谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了lGOX在*** Bl21中的异源表达及酶学特性,为生物转化合成α-KG提供了新的参考途径。

关键词：白丝北里孢菌 l-谷氨酸氧化酶 α-酮戊二酸异源表达酶学性质

一株产l-谷氨酸氧化酶的链霉菌分离鉴定及酶学性质分析

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生物技术通报 2012年第12期28卷 144-149页

作者：卢婵郑璞孙志浩江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

采用4-氨基安替吡啉/苯酚显色反应,从土壤中分离出产酶菌株Str-6。通过菌株形态、培养特征和生理生化试验、16S rDNA序列分析,初步将其鉴定为山丘链霉菌。其初步酶学性质研究表明,该菌株所产l-谷氨酸氧化酶为胞外酶,28℃培养36 h时产酶... 详细信息

采用4-氨基安替吡啉/苯酚显色反应,从土壤中分离出产酶菌株Str-6。通过菌株形态、培养特征和生理生化试验、16S rDNA序列分析,初步将其鉴定为山丘链霉菌。其初步酶学性质研究表明,该菌株所产l-谷氨酸氧化酶为胞外酶,28℃培养36 h时产酶酶活达到0.023 1 U/mg蛋白,对l-谷氨酸具有较强的底物专一性。酶作用最佳反应pH为6.0,反应温度为35℃。在pH6.0-7.0和温度35-40℃下具有较好的稳定性。

关键词： l-谷氨酸氧化酶筛选鉴定山丘链霉菌酶学性质

l—谷氨酸氧化酶的来源和特性及其在生化检验中的应用

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检验医学教育 2003年第2期10卷 32-35页

作者：郑强严卫民徐东王绪明罗侃崔有宏乌鲁木齐军医学院生化教研室新疆乌鲁木齐830000 解放军兰州医高专生化教研室甘肃兰州730020

l—谷氨酸氧化酶的发现是近20年的事情。它是一种十分有用的工具酶,在临床生化检验上,可以用于测定丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转酶和γ—谷氨酰基转移酶等的活性以及肌酐等的浓度。此外,在医药工业和食品工业上也有重要的应用。本... 详细信息

l—谷氨酸氧化酶的发现是近20年的事情。它是一种十分有用的工具酶,在临床生化检验上,可以用于测定丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转酶和γ—谷氨酰基转移酶等的活性以及肌酐等的浓度。此外,在医药工业和食品工业上也有重要的应用。本文对该酶的来源、特性和应用等有关的文献作了系统回顾和综述。

关键词： l-谷氨酸氧化酶生化检验转氨酶 γ-谷氨酰基转移酶肌酐尿素