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氮化碳接枝l-谷氨酰胺分子实现高效光催化产氢和降解性能

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化工进展 2023年第12期42卷 6372-6382页

作者：刘飞陈哲陈峰吉林化工学院材料科学与工程学院吉林吉林132022 吉林石化公司有机合成厂吉林吉林132021

将尿素和l-谷氨酰胺(lg)作为前体材料,使用冷冻-煅烧法成功将lg分子链接枝到了氮化碳(CN)的边缘,制备了具有优异光催化性能lg接枝修饰的多孔氮化碳(lCN)光催化剂。通过X射线衍射光谱(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FT... 详细信息

将尿素和l-谷氨酰胺(lg)作为前体材料,使用冷冻-煅烧法成功将lg分子链接枝到了氮化碳(CN)的边缘,制备了具有优异光催化性能lg接枝修饰的多孔氮化碳(lCN)光催化剂。通过X射线衍射光谱(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)等表征测试方法对样品的形貌结构以及光催化性能进行了测试。结果表明,lg分子链的引入不仅能够增加材料的比表面积,提供更多的活性位点,同时还可以有效促进光生电子的快速分离和转移,从而获得优异的光催化活性。在可见光的照射下,最优质量比的lCN-10光催化剂在析氢测试过程中产氢速率高达658µmol/(g·h),约是纯相CN的3倍。并且在光降解盐酸四环素(TCH)和左氧氟沙星(lEV)的测试中,lCN-10也表现出良好的催化活性,在60min内对TCH和lEV的光降解率达到了98%及85%。这项工作为CN基光催化材料的表面修饰与性能优化提供了新的视角。

关键词：光催化制氢降解氮化碳 l-谷氨酰胺

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成l-谷氨酰胺

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食品与生物技术学报 2022年第8期41卷 65-74页

作者：乔郅钠吕青兰李翔飞王晴徐美娟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

l-谷氨酰胺(l-glutamine,l-Gln)是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产l-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性... 详细信息

l-谷氨酰胺(l-glutamine,l-Gln)是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产l-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性能欠缺等问题严重限制了其工业化应用。为解决这一问题,作者以实验室前期构建的l-Gln生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体l-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、过表达溶氧相关蛋白VHb提高细胞携氧能力、增强关键酶谷氨酰胺合成酶催化活性及发酵工艺优化等策略提高了l-Gln产量。最终的基因工程菌CGQ08/pDXW10-glnASc-gdhCg在5 l发酵罐上补料分批发酵66 h,l-Gln的产量最高达(94.5±1.8)g/l,糖酸转化率为34.8%,生产强度为1.43 g/(l·h)。本研究为l-Gln及其相关化合物的工业化生产提供了借鉴。

关键词： l-谷氨酰胺谷氨酸棒杆菌谷氨酰胺合酶 NADPH供应 ATP供应发酵工艺优化

柱前衍生化HPlC测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中的l-谷氨酰胺

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中国现代应用药学 2022年第1期39卷 78-81页

作者：谷亦平杨园桂林医学院公共卫生学院广西桂林541199 武汉药品医疗器械检验所武汉430075 广西环境暴露组学与全生命周期健康重点实验室广西桂林541199

目的建立柱前衍生化HPlC测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中l-谷氨酰胺的含量。方法采用CAPCEll PAK C_(18)色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以乙酸钠缓冲液(pH 6.4)-乙腈为流动相,梯度洗脱,检测波长为254 nm。以牛磺酸为内标物质,异硫氰酸苯酯为... 详细信息

目的建立柱前衍生化HPlC测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中l-谷氨酰胺的含量。方法采用CAPCEll PAK C_(18)色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以乙酸钠缓冲液(pH 6.4)-乙腈为流动相,梯度洗脱,检测波长为254 nm。以牛磺酸为内标物质,异硫氰酸苯酯为衍生剂,采用单因素和正交试验确定衍生反应最佳条件。结果l-谷氨酰胺在0.0159~0.143 mg·ml^(–1)内线性关系良好(r^(2)=0.9999),加样回收率为100.3%,RSD为0.8%(n=9)。结论本方法准确、重复性好,可用于复方谷氨酰胺肠溶胶囊中l-谷氨酰胺的含量测定。

关键词：复方谷氨酰胺肠溶胶囊 l-谷氨酰胺柱前衍生高效液相色谱法

D,l-肽链内切酶基因cwlO缺失促进地衣芽孢杆菌利用l-谷氨酰胺合成聚γ-谷氨酸

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微生物学通报 2023年第7期50卷 2798-2811页

作者：王思李鑫彭芳刘军占杨杨陈守文武汉轻工大学生命科学与技术学院湖北武汉430023 湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062

【背景】聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid, γ-PGA)是一种由芽孢杆菌代谢产生的同质氨基酸聚合物,在众多领域具有广泛的应用潜力。芽孢杆菌cwlO表达一种D,l-肽链内切酶,其对γ-PGA合成的影响机理尚不清晰。【目的】探究缺失cwlO对以... 详细信息

【背景】聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid, γ-PGA)是一种由芽孢杆菌代谢产生的同质氨基酸聚合物,在众多领域具有广泛的应用潜力。芽孢杆菌cwlO表达一种D,l-肽链内切酶,其对γ-PGA合成的影响机理尚不清晰。【目的】探究缺失cwlO对以不同前体发酵γ-PGA的影响及其机制。【方法】以地衣芽孢杆菌WX-02为出发菌株,构建缺失cwlO的重组菌。在3l发酵罐条件下对比重组菌和野生菌利用不同前体发酵产γ-PGA的发酵性能,并通过转录水平差异分析、荧光倒置显微镜观察、细胞壁肽聚糖含量和组分分析造成重组菌和野生菌发酵性能差异的原因。【结果】缺失cwlO的重组菌对l-谷氨酰胺的代谢利用效率显著提高,以l-谷氨酰胺和l-谷氨酸为混合前体时,重组菌的γ-PGA产量达到36.3g/l,比野生菌高48.8%。RT-qPCR结果表明,相较于野生菌,重组菌在利用l-谷氨酰胺时γ-PGA合成途径和呼吸链上关键基因转录水平均上调。荧光倒置显微镜观察发现重组菌细胞形态相比野生菌变短变圆,细胞壁肽聚糖含量和组分测定发现,重组菌细胞壁肽聚糖含量降低,且肽聚糖中蛋白质占比减少。【结论】地衣芽孢杆菌cwlO的缺失引起细胞壁肽聚糖含量降低,促进了菌株对l-谷氨酰胺的利用,强化了γ-PGA的合成,这为探究cwlO对γ-PGA合成的影响提供了新的思路和研究基础。

关键词： γ-聚谷氨酸 cwlO l-谷氨酰胺地衣芽孢杆菌

l-谷氨酰胺基因工程菌构建及其发酵工艺优化研究

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L-谷氨酰胺基因工程菌构建及其发酵工艺优化研究

作者：刘云鹏天津科技大学

学位级别：硕士

l-谷氨酰胺是l-谷氨酸的γ羧基酰胺化的一种中性氨基酸,是构成生物体蛋白质的20种基本氨基酸之一。l-谷氨酰胺在维持人体机能和生命活动方面具有重要作用,其在人体内含量非常高,占人体游离氨基酸的61%。近年来,随着对l-谷氨酰胺的深入研... 详细信息

l-谷氨酰胺是l-谷氨酸的γ羧基酰胺化的一种中性氨基酸,是构成生物体蛋白质的20种基本氨基酸之一。l-谷氨酰胺在维持人体机能和生命活动方面具有重要作用,其在人体内含量非常高,占人体游离氨基酸的61%。近年来,随着对l-谷氨酰胺的深入研究,l-谷氨酰胺被广泛应用于医药,保健食品,饲料等领域。目前,l-谷氨酰胺发酵的主要问题包括:发酵副产物谷氨酸含量偏高,谷氨酰胺产量低,关键酶谷氨酰胺合成酶的活性弱,生物素亚适量工艺培养基不稳定,发酵后期菌体活力和产酸效率下降严重,糖酸转化率低。本课题通过理性代谢工程改造和发酵工艺优化来解决上述问题。以谷氨酰胺生产菌GM34为出发菌株,优化了谷氨酸棒杆菌的GS-GOGAT途径:敲除谷氨酸合酶基因NCgl0181、NCgl0182和谷氨酰胺酶基因NCgl2395、NCgl2500,在基因组NCgl0182和NCgl2500位点上分别整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因gln A和一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因gln A;进一步的,使用带有tuf强启动子的p XT01质粒分别过表达了gln A和gln A。构建得到菌株G-6的谷氨酰胺产量比原菌GM34提高了41.9%,达到68.4 g/l,谷氨酸含量降低了56.9%,达到13.1 g/l,糖酸转化率提高了6.6%,达到37.1%。以菌株G-6为出发菌株,优化谷氨酸棒杆菌的氮调控系统,敲除谷氨酸棒杆菌的氮调控全局阻遏因子amtr、谷氨酰胺合成酶腺苷转移酶基因gln E,并强化了谷氨酸棒杆菌中的两个铵转运蛋白基因amt和amtb。构建菌株G-11,谷氨酰胺产量达到80.3 g/l,谷氨酸含量达到10.6 g/l,糖酸转化率达到38.3%。菌株G-11为本课题构建的谷氨酰胺生产能力最强菌株,具有工业化潜力。传统生物素亚适量工艺使用的玉米浆生物素含量不确定,会导致各批次发酵结果不稳定,为解决这个问题,探究了生物素的添加方式对谷氨酰胺发酵的影响。通过在种子培养基中添加40 m l/l豆浓和25μg/lV,在发酵培养基中添加50m l/l豆浓和4μg/lV代替传统生物素亚适量工艺的玉米浆成分,得到了一种新型的谷氨酰胺发酵培养基,使谷氨酰胺产量提高至48.2 g/l,谷氨酸含量降低至30.4 g/l,糖酸转化率提高到32.5%。NH是谷氨酰胺发酵中的关键因素,谷氨酸经谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺需要NH,但高浓度的NH会影响菌体生长并降低谷氨酰胺合成酶活性。在低浓度NH条件下,谷氨酰胺合成酶活性处在高水平,但是NH浓度过低,会减少谷氨酰胺生成。为解决谷氨酰胺发酵发酵过程中NH用量的矛盾,提高谷氨酰胺合成酶活性,设计一种NH限制发酵工艺,探究NH浓度对谷氨酰胺发酵的影响并对NH浓度进行调控。发酵前期添加2 g/l尿素,当尿素被耗尽,p H在3 h左右回落至中性,开始使用25%的氨水调节p H,并同时开始梯度流加(NH)SO至发酵结束。有效提高了谷氨酰胺合成酶活性并使谷氨酰胺产量提高了12.8%,达到90.6 g/l,谷氨酸含量降低了32.3%,达到6.7 g/l,糖酸转化率提高了3.8%,达到40.9%。针对发酵后期产酸效率下降,菌体衰亡老化的问题,设计了全营养流加发酵工艺并探究了流加甜菜碱和氯化胆碱对谷氨酰胺发酵影响。将发酵培养基按4∶6分成发酵初始培养基和发酵流加培养基;将3 g/l甜菜碱和2 g/l氯化胆碱添加到葡萄糖糖液内随着葡萄糖的流加补充。使用最佳的全营养流加策略以及甜菜碱和氯化胆碱的流加策略,谷氨酰胺产量提高了2.9%,达到96.3 g/l,谷氨酸含量降低了22.4%,达到5.2 g/l,糖酸转化率提高了0.7%,达到41.6%。本课题以谷氨酰胺生产菌GM34为出发菌株,构建出一株谷氨酰胺生产能力最强的菌株G-11,并对谷氨酰胺发酵工艺进行优化。最终的谷氨酰胺产量达到96.3 g/l,谷氨酸含量5.2 g/l,糖酸转化率41.6%。

关键词： l-谷氨酰胺 NH4+限制发酵工艺全营养流加氮调控系统谷氨酸棒杆菌

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高效合成l-谷氨酰胺

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代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酰胺

作者：吕青兰江南大学

学位级别：硕士

l-谷氨酰胺(l-glutamine,l-Gln)是一种条件必需氨基酸,因其具有免疫和营养双重生理功能,被广泛应用于医药、食品保健品、饲料等行业。本研究以实验室保藏的一株l-Gln产量为25.7±2.7 g·l的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum N01... 详细信息

l-谷氨酰胺(l-glutamine,l-Gln)是一种条件必需氨基酸,因其具有免疫和营养双重生理功能,被广泛应用于医药、食品保健品、饲料等行业。本研究以实验室保藏的一株l-Gln产量为25.7±2.7 g·l的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum N01为出发菌株,进行一系列理性代谢改造及发酵工艺优化,以提高l-Gln的产量。主要研究结果如下:(1)增强l-Gln合成代谢流。首先对出发菌N01发酵液进行氨基酸谱测定,发现主要的副产物为l-谷氨酸和l-脯氨酸。敲除l-脯氨酸合成关键酶γ-谷氨酸激酶基因pro B,阻断l-脯氨酸合成途径,构建菌株CGQ01,l-Gln产量为27.2±2.5 g·l。敲除CGQ01中编码谷氨酸机械通道蛋白基因NCgl1221,构建菌株CGQ02,l-谷氨酸胞内含量提高、胞外分泌降低了40.3%至9.2 g·l,l-Gln产量提高至31.3±2.4 g·l。(2)增强关键酶谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)催化活性。敲除CGQ02中GS腺苷酰化转移酶基因gln E,解除GS腺苷酰化作用,CGQ03菌株的GS酶活性较CGQ02提高了128.6%,l-Gln产量提高至36.2±2.5 g·l。接着,从8种不同物种来源GS中筛选获得了一个具有高催化活性的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae来源的Sc GS进行过表达,重组菌GS酶活性提高了8.3倍,l-Gln产量提高了26.8%至45.9±1.4 g·l,说明增强GS催化活性是实现l-Gln增产的有效策略。(3)增强胞内ATP供应。在CGQ03中过表达大肠杆菌来源多聚磷酸盐激酶基因ppk,构建ATP再生系统,重组菌CGQ03/p XMJ19-ppk 胞内ATP含量较CGQ03提高了22.6%,l-Gln的产量提高了13.8%至41.2±2.7 g·l。进一步地,将筛选获得的Sc GS酶基因gln A和ppk 在CGQ03中串联表达,重组菌CGQ03/p XMJ19-gln A-ppk 可生产49.5±3.9 g·ll-Gln。通过RBS(Ribosome binding site,RBS)工程筛选获得了较强的RBS5进一步提高基因表达水平,重组菌CGQ03/p XMJ19-R5-gln A-ppk l-Gln产量达52.8±4.1 g·l。(4)两阶段p H调控策略优化。根据Cg GS酶学性质,探究不同p H对l-Gln发酵的影响,确定产酸期最佳p H为6.2,解决了菌体生长和发酵产酸之间的不平衡,优化了两阶段p H调控策略。工程菌CGQ03/p XMJ19-R5-gln A-ppk 在5 l发酵罐上利用优化后的两阶段p H调控策略,发酵66 h l-Gln产量为73.5±3.1 g·l,糖酸转化率为36.8%。(5)溶氧控制对l-Gln发酵的影响。比较了不控溶氧(恒定转速和通气量)和控制溶氧水平在30%-40%(转速偶联溶氧及手动提高通气量)两种方式对l-Gln发酵的影响。实验结果显示控制溶氧水平更有利于菌体生长和l-Gln的发酵。最终的工程菌CGQ03/p XMJ19-R5-gln A-ppk 在5 l发酵罐补料分批发酵66 h,l-Gln的产量最高为89.2±1.7 g·l,糖酸转化率为33.5%,生产强度为1.35 g·l·h。

关键词： l-谷氨酰胺谷氨酸棒杆菌代谢工程谷氨酰胺合成酶 ATP再生

l-谷氨酰胺通过TGF-β1/SMAD2/3信号通路上调lncRNA-NKIlA表达缓解骨关节炎

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L-谷氨酰胺通过TGF-β1/SMAD2/3信号通路上调lncRNA-NKILA表达缓...

作者：马潇安徽医科大学

学位级别：硕士

背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)作为一种具有广泛潜在途径的异质性疾病,受年龄、体重、炎症、创伤、遗传等多种致病因素影响,以软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成等为主要特征,其中软骨细胞凋亡、细胞外基质降解及促炎介质的过度产生... 详细信息

背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)作为一种具有广泛潜在途径的异质性疾病,受年龄、体重、炎症、创伤、遗传等多种致病因素影响,以软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成等为主要特征,其中软骨细胞凋亡、细胞外基质降解及促炎介质的过度产生导致滑膜和髌下脂肪垫产生局部炎症等病理过程参与了OA的主要发生和发展。目前早期OA的非手术治疗主要以缓解症状为主,虽然可减轻患者疼痛但不能延缓OA的病理进程。l-谷氨酰胺(l-glutamine,l-Gln)在细胞组成、器官间氮交换、体内PH的调节等生理代谢过程中起着至关重要的作用,是人体中最丰富、用途最广的条件必需氨基酸(即在某些条件下,如压力下,氨基酸水平需要提高)。但目前l-Gln对OA的治疗作用及其分子机制尚未有系统阐述。因此,本研究旨在探讨l-Gln对软骨细胞炎症、大鼠OA模型和部分早期膝关节OA患者(Kellgren-lawrence,K-lⅠ～Ⅱ)的治疗作用及可能分子机制的研究。方法选取健康成年的S-D大鼠,提取其膝关节表面的软骨细胞并进行原代细胞的培养。用CCK-8检测l-Gln在不同浓度下(0,5,10和20 m M)对Sprague Dorey(S D)大鼠原代软骨细胞活力的作用。用Il-1β构建SD大鼠软骨细胞的体外OA模型,实验分为5组:Control组、Il-1β组,Il-1β+5m M l-Gln组,Il-1β+10m M l-Gln组,Il-1β+20m M l-Gln组。用Griess试剂检测Nitrite水平,Enzyme-linked Immunosorbent Assay实验检测Prostaglandin E-2(PGE-2),Tumour Necrosis Factor-α(TNF-α)水平。使用q RT-PCR,WB,Immunofluorescence(IF),Immunohistochemical(ICH)及Haematoxylin and Eosin(HE)等实验方法分别从体内外检测各组SD大鼠软骨中细胞外基质(CollagenⅡ,Aggrecan),促炎介质(i NOS,COX-2和MMP-13)等的相的对表达水平。利用q RT-PCR,WB,IF等技术检测各组Smad2/3诱导的lnc RNA—NKIlA通过负反馈抑制大鼠软骨细胞NF-κB通路的过度激活情况。最后通过Kellgren-lawrence分级筛选出早期膝OA(K-lⅠ～Ⅱ)的门诊病人,通过给患者口服l-Gln 1个月后使用WOMAC量表、VSA和lequesne评分对患者OA症状进行疾病综合评估。结果在体外,l-Gln可以上调Il-1β诱导的大鼠软骨细胞中TGF-β1/Smad2/3调控的lnc RNA-NKIlA的表达,抑制NF-κB的过度激活,降低软骨细胞炎症介质(i NOS,COX-2和MMP-13)的表达,进而减少NO,PGE-2,TNF-α等相关促炎因子的产生和细胞外基质(Aggrecan,CollagenⅡ)的降解。在体内,灌胃l-Gln可以减少OA大鼠软骨组织的降解及降低MMP-13的表达。在Ⅳ期临床试验阶段,l-Gln可以显著缓解早期膝关节OA患者的临床症状。结论l-Gln可能成为一种潜在的早期OA治疗药物,用于延缓OA的发生和发展过程,为OA的防治提供了新见解。

关键词：骨关节炎 l-谷氨酰胺 NF-κB 长链非编码RNA NKIlA

以l-谷氨酰胺为手性选择剂毛细管电泳拆分几种药物旋光对映体

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分析化学 2000年第10期28卷 1287-1290页

作者：李关宾林秀丽主沉浮吴培关亚风山东轻工业学院化学工程系!济南25010 中国科学院大连化学物理研究所!大连160011

以Ｌ－谷氨酰胺为手性选择剂，建立了对普萘洛尔、慢心律、心律平、苯丙哌酮、异丙肾上腺素、氯胺酮、山莨菪碱、洛贝林、布比卡因、苯海索等１０种手性药物对映体的毛细管电泳快速分离方法，在含有６０ｍｍｏｌ／ＬＬ－谷氨酰胺，６... 详细信息

以Ｌ－谷氨酰胺为手性选择剂，建立了对普萘洛尔、慢心律、心律平、苯丙哌酮、异丙肾上腺素、氯胺酮、山莨菪碱、洛贝林、布比卡因、苯海索等１０种手性药物对映体的毛细管电泳快速分离方法，在含有６０ｍｍｏｌ／ＬＬ－谷氨酰胺，６０ｍｍｏｌ／Ｌ硼砂（ｐＨ＝９．２５）的缓冲溶液中，１０种手性药物在１１ｍｉｎ内达到基线分离。并对分离机理作了初步探讨。

关键词：手性分离药物对映体 l-谷氨酰胺毛细管电泳

l-谷氨酰胺对PC12细胞中grp75的调控作用

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实验生物学报 2005年第5期38卷 423-431页

作者：刘雯张艳吴青锋李锦燕左伋复旦大学上海医学院细胞与遗传医学系上海200032

条件必需氨基酸谷胺酰胺可上调细胞中热激蛋白(hsp)的表达,为观察谷氨酰胺是否对hsp 家族成员grp75的表达具有调控作用,以PC12细胞为模型用免疫组化、蛋白质印迹法和RT-PCR 等方法检测谷胺酰胺对grp75基因的表达的影响;并以MTT法观察谷... 详细信息

条件必需氨基酸谷胺酰胺可上调细胞中热激蛋白(hsp)的表达,为观察谷氨酰胺是否对hsp 家族成员grp75的表达具有调控作用,以PC12细胞为模型用免疫组化、蛋白质印迹法和RT-PCR 等方法检测谷胺酰胺对grp75基因的表达的影响;并以MTT法观察谷氨酰胺对PC12的细胞和grp75低表达的PC12细胞缺糖损伤的保护作用。结果表明谷氨酰胺可以上调grp75的表达,特别是对缺糖细胞的上调作用更显著;但这种上调作用与谷氨酰胺的作用浓度和作用时间并未显示出有明显的关系。MTT检测显示,谷氨酰胺使细胞在缺糖条件下的存活率明显上升;grp75低表达细胞与未转染的细胞相比这种保护效应明显降低。

关键词： l-谷氨酰胺葡萄糖调节蛋白缺糖损伤 PC12细胞 grp75 调控作用条件必需氨基酸蛋白质印迹法保护作用 MTT法