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大肠杆菌l-苏氨酸脱氢酶的高效表达及其酶学性质分析

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食品科学 2023年第18期44卷 85-92页

作者：刘欣欣王瑶史红玲姚伦广王贤唐存多南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南南阳473061 赊店老酒股份有限公司博士后创新实践基地河南南阳473300 河南农业大学食品科学技术学院河南郑州450002

为提高l-苏氨酸脱氢酶(l-threonine dehydrogenase,l-TDH)催化l-苏氨酸脱氢合成l-2-氨基乙酸乙酯效率,通过基因挖掘的手段挖掘出来自大肠杆菌(Escherichia coli)的l-TDH,再借助pACYCDuet-1表达系统将其在E. coli Bl21(DE3)中进行可溶性表达及鉴定。结果表明,l-TDH在E. coli Bl21(DE3)中实现了高水平的可溶性表达,其裂解液中的酶活力为19.13 IU/ml,约为E. coli Bl21(DE3)本底表达水平的79倍。纯化后的比活力为12.77 IU/mg,它的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为9.0,在35℃和40℃保温120 min,残留酶活力仍能达到90%以上。此外,Ec TDH动力学参数也优于其他已报道的l-TDH,在转化l-苏氨酸合成2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)的过程中具有更大优势,也为实现转化l-苏氨酸合成2,5-DMP的工业化生产奠定了理论基础。

关键词： l-苏氨酸 l-苏氨酸脱氢酶大肠杆菌表达生物转化

大肠杆菌PTS^(Ntr)相关基因缺失对l-苏氨酸合成的影响

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食品与生物技术学报 2023年第2期42卷 31-39页

作者：张淑嫣胡晓清李莹王小元食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学国际食品安全联合实验室江苏无锡214122

大肠杆菌的氮磷酸转移酶系统(nitrogen phosphotransferase system,PTSNtr)在其工作过程中会消耗l-苏氨酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸,敲除相关基因或可影响苏氨酸合成。作者利用CRISPR-Cas9系统,分别敲除PTSNtr相关基因ptsP、ptsO... 详细信息

大肠杆菌的氮磷酸转移酶系统(nitrogen phosphotransferase system,PTSNtr)在其工作过程中会消耗l-苏氨酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸,敲除相关基因或可影响苏氨酸合成。作者利用CRISPR-Cas9系统,分别敲除PTSNtr相关基因ptsP、ptsO和ptsN,构建得到突变株MZ001、MZ002和MZ003。通过对出发菌株和突变菌株测定生长曲线,发现ptsP、ptsO和ptsN的单缺失使菌株培养前期生长迟缓,迟滞期延长,后期快速生长,稳定期生物量积累大于出发菌株。之后在出发菌株和突变菌株中引入含有苏氨酸合成的3个关键酶编码基因thrA*、thrB和thrC以及苏氨酸转运蛋白编码基因rhtC的表达质粒。对比菌株MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC,菌株MZ001/pFW01-thrA*BC-rhtC、MZ002/pFW01-thrA*BC-rhtC和MZ003/pFW01-thrA*BC-rhtC苏氨酸的产量有明显提高,分别为3.805、1.722、3.091 g/l,表明大肠杆菌的PTSNtr相关基因的敲除对提高其l-苏氨酸的合成能力有促进作用。

关键词：大肠杆菌 l-苏氨酸氮磷酸转移酶系统

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抗噬菌体l-苏氨酸工程菌的选育及机理分析

饲料研究 2022年第9期45卷 100-105页

作者：王强杨立鹏魏爱英孟刚宁夏医科大学医学科学技术研究中心宁夏银川750001 宁夏伊品生物科技股份有限公司宁夏银川750100

试验通过常压室温等离子体诱变苏氨酸生产菌,筛选获得具有噬菌体抗性的苏氨酸基因工程菌株。从苏氨酸发酵染噬菌体发酵液中分离得到混合噬菌体(P-1)。以P-1为筛选因子,通过常压室温等离子体诱变苏氨酸生产菌YPT、抗性初筛、溶原性验证... 详细信息

试验通过常压室温等离子体诱变苏氨酸生产菌,筛选获得具有噬菌体抗性的苏氨酸基因工程菌株。从苏氨酸发酵染噬菌体发酵液中分离得到混合噬菌体(P-1)。以P-1为筛选因子,通过常压室温等离子体诱变苏氨酸生产菌YPT、抗性初筛、溶原性验证、噬菌体抗性遗传稳定性验证、发酵罐产酸等验证。结果显示:通过筛选得到1株对P-1具有稳定抗性的苏氨酸生产菌株,命名为YPT-1。在分子水平上对突变株YPT-1抗噬菌体的机制做初步研究。采用CRISPR技术进行敲除验证,证实fhuA基因的缺失可致使菌株获得噬菌体抗性。研究表明,经过初步产酸验证,此菌株产酸指标与对照株(诱变出发菌YPT)相比未下降,且产酸稳定,具有较好的工业化应用价值。

关键词： l-苏氨酸大肠杆菌 ARTP诱变筛选 fhuA

重组大肠杆菌全细胞催化l-苏氨酸合成l-2-氨基丁酸

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重组大肠杆菌全细胞催化L-苏氨酸合成L-2-氨基丁酸

作者：李莹南阳师范学院

学位级别：硕士

l-2-氨基丁酸（l-2-aminobutyric acid,l-2-ABA）属于有手性性质的非天然的氨基酸,l-2-氨基丁酸既是有着不可替代地位的化工原料,也是重要的医药前体,在化工业和医药行业的应用颇多。它是高需求药物制备流程中的关键中间体,因此l-2-氨... 详细信息

l-2-氨基丁酸（l-2-aminobutyric acid,l-2-ABA）属于有手性性质的非天然的氨基酸,l-2-氨基丁酸既是有着不可替代地位的化工原料,也是重要的医药前体,在化工业和医药行业的应用颇多。它是高需求药物制备流程中的关键中间体,因此l-2-氨基丁酸的需求量也相应提高,由此使得其制备技术成为热门话题。本研究以探索l-2-氨基丁酸的高效绿色合成工艺为主。首先,通过基因工程技术、手段构建了以重组大肠杆菌作为生物催化平台的反应体系。其次,以重组大肠杆菌全细胞为催化剂合成l-2-氨基丁酸。最后,以高活性甲酸脱氢酶构建的辅酶再生系统参与l-2-氨基丁酸的高效全细胞生物合成,并通过单因素实验探索出全细胞催化绿色合成l-2-氨基丁酸的最适反应条件,实现了l-2-氨基丁酸的绿色高效合成。主要研究内容及结果如下:（1）以E.coli Bl21（DE3）的基因组序列为模板,利用特异性引物成功获得了苏氨酸脱氨酶的编码基因EcTD。然后将此段编码序列插入表达质粒pACYCDuet-l,构建重组菌株E.coli Bl21（DE3）/pACYCDuet-1-EcTD。最后利用特异性引物扩增l-亮氨酸脱氢酶的编码基因EsleuDH（来源于Exiguobacterium sibiricum）,并将这段基因序列插入表达质粒p ACYCDuet-l另一克隆位点,构建重组菌株E.coli Bl21（DE3）/pACYCDuet-1-EcTD-EsleuDH。在该重组菌中,苏氨酸脱氨酶与l-亮氨酸脱氢酶成功实现共表达。（2）将重组质粒pACYCDuet-1-EcTD-EsleuDH和pET28a-CbFDH转入同一个感受态细胞,构建成双质粒共表达重组菌E.coli Bl21（DE3）/pACYCDuet-1-EcTD-EsleuDH:pET28a-CbFDH。利用该重组大肠杆菌进行全细胞l-2-氨基丁酸的生物合成。在250 ml三角瓶中构建50 ml反应体系,体系包括:200 mmol/l l-苏氨酸、200 mmol/l甲酸铵、0.75 mmol/l NAD、50 mg冻干的重组大肠杆菌和适量的玻璃珠,并于30℃、220 rpm振荡反应12 h时,测得在上述反应体系中,l-2-氨基丁酸的得率为71%。（3）利用突变体CbFDH构建了双质粒共表达重组菌E.coli Bl21（DE3）/pACYCDuet-1-EcTD-EsleuDH:pET28a-CbFDH。在250 ml三角瓶中构建50ml的反应体系,体系中包括:200 mmol/l l-苏氨酸、200 mmol/l甲酸铵、0.75mmol/l NAD、50 mg冻干的重组大肠杆菌和适量的玻璃珠,并于30℃、220 rpm振荡反应12 h时,测得在上述反应体系中,l-2-氨基丁酸的得率为85%,与以重组菌E.coli Bl21（DE3）/pACYCDuet-1-EcTD-EsleuDH:pET28a-CbFDH全细胞催化合成l-2-氨基丁酸的得率相比,l-2-氨基丁酸的得率提高了14%。结果证明通过提高甲酸脱氢酶的表达水平提高辅酶再生能力,的确能够提高l-2-氨基丁酸的生物合成效率。（4）为了探究反应条件对l-2-氨基丁酸合成效率的影响,在本研究中,控制了反应pH和反应温度。最终得到在pH 7.8,温度35℃时,相同反应体系中l-2-氨基丁酸的得率可以达到93.5%,时空产率可以达到3.09 g/(l·h)。

关键词： l-2-氨基丁酸 l-苏氨酸共表达微生物细胞工厂全细胞催化生物工程

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代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产l-苏氨酸

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-苏氨酸

作者：刘建行齐鲁工业大学

学位级别：硕士

l-苏氨酸是人类和动物营养的一种必需氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料等领域,全球市场规模超70万吨/年。l-苏氨酸是猪饲料的第二限制性氨基酸,家禽饲料的第三限制性氨基酸,主要用途是作为饲料添加剂。目前工业上是通过大肠杆菌(Esche... 详细信息

l-苏氨酸是人类和动物营养的一种必需氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料等领域,全球市场规模超70万吨/年。l-苏氨酸是猪饲料的第二限制性氨基酸,家禽饲料的第三限制性氨基酸,主要用途是作为饲料添加剂。目前工业上是通过大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产l-苏氨酸。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为谷氨酸和l-赖氨酸等氨基酸工业生产底盘,具有生物安全、环境适应性强等优势,是l-苏氨酸高效生产的潜力菌株。然而,目前谷氨酸棒杆菌生产l-苏氨酸容易积累大量其它氨基酸副产物,导致l-苏氨酸水平仍然有限。已有研究阻断或弱化副产物合成途径的策略,会导致菌株为营养缺陷型或仅能部分降低副产物积累。本研究从野生型谷氨酸棒杆菌出发,首先通过解除l-苏氨酸合成途径关键酶的反馈抑制以及增强关键基因的表达,实现了l-苏氨酸及副产物的合成;其次通过增强2种副产物合成途径的反馈抑制,大幅降低副产物的积累;最后过表达l-苏氨酸外排蛋白和高丝氨酸激酶,进一步提高l-苏氨酸产量并降低副产物积累。主要研究内容和结果如下:(1)l-苏氨酸合成途径的改造:在野生型谷氨酸棒杆菌中,针对lysC(编码天冬氨酸激酶)基因和hom(编码高丝氨酸脱氢酶)基因,分别引入已报道的T311I和G378E点突变解除反馈抑制,l-苏氨酸产量达到0.27 g/l。分别采用强启动子P和P增强lys C-asd和hom-thr B操纵子的表达,l-苏氨酸产量提高至2.33 g/l,同时副产物l-赖氨酸、l-异亮氨酸、甘氨酸和l-高丝氨酸产量也达到0.47-0.96 g/l。(2)l-苏氨酸发酵副产物合成途径的改造:采用异源强反馈抑制关键酶基因替换谷氨酸棒杆菌内源基因,实现副产物合成控制,同时不导致菌株营养缺陷型。通过来源于肺炎球菌的二氢吡啶二羧酸合成酶基因Spdap A替换,增强l-赖氨酸合成途径的反馈抑制,孔板发酵显示不再积累l-赖氨酸;通过来源于大肠杆菌的苏氨酸脱水酶基因EcilvA替换,增强l-异亮氨酸合成途径的反馈抑制,l-异亮氨酸产量也可从0.42 g/l降低至0.03 g/l。改造后菌株的孔板发酵,不需要额外添加任何营养物质,l-苏氨酸或前体l-高丝氨酸产量可小幅提高。(3)l-苏氨酸外排蛋白和高丝氨酸激酶的过表达:分别过表达不同来源的l-苏氨酸外排蛋白,包括谷氨酸棒杆菌内源的Thr E和Ser E以及大肠杆菌来源的Rht C。结果显示Rht C过表达效果最显著,l-苏氨酸产量从2.98 g/l提高至9.07g/l,提高了2.04倍;然而其导致前体l-高丝氨酸产量也从0.71 g/l提高至2.10g/l。为了减少l-高丝氨酸的积累,进一步过表达了高丝氨酸激酶基因thr B,孔板发酵显示l-高丝氨酸产量可降低至0.15 g/l。从头构建的工程菌Zcgl T11在5 l罐进行发酵罐生产评价,l-苏氨酸产量可达67.63 g/l,糖酸转化率0.21 g/g,生产强度为1.21 g/l/h;发酵过程无l-赖氨酸积累,发酵终点l-异亮氨酸和甘氨酸积累量约1 g/l,l-高丝氨酸产量为4.58 g/l。本研究通过l-苏氨酸和副产物氨基酸合成途径的反馈抑制重构及表达调控,从头构建了非营养缺陷型谷氨酸棒杆菌l-苏氨酸生产菌,多种副产物氨基酸积累量显著降低,l-苏氨酸产量和生产强度均高于谷氨酸棒杆菌中目前报道的最高水平。本研究开发的副产物控制策略,为解决谷氨酸棒杆菌生产l-苏氨酸副产物问题提供了一个新思路,也可以为构建其它氨基酸生产菌株提供借鉴。

关键词：谷氨酸棒杆菌 l-苏氨酸代谢工程副产物反馈抑制

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基于代谢途径分析的l-苏氨酸合成代谢调控

基于代谢途径分析的L-苏氨酸合成代谢调控

作者：杨强江南大学

学位级别：硕士

l-苏氨酸参与蛋白质合成以及生命代谢活动,广泛应用于食品、饲料医药等领域。目前,工业化生产l-苏氨酸是以大肠杆菌等微生物进行直接发酵,具有成本低、生产强度高的特点。为了阐明大肠杆菌中l-苏氨酸合成途径中的关键代谢特征,以便对菌... 详细信息

l-苏氨酸参与蛋白质合成以及生命代谢活动,广泛应用于食品、饲料医药等领域。目前,工业化生产l-苏氨酸是以大肠杆菌等微生物进行直接发酵,具有成本低、生产强度高的特点。为了阐明大肠杆菌中l-苏氨酸合成途径中的关键代谢特征,以便对菌株进行代谢调控或代谢工程改造,本研究围绕一株l-苏氨酸高产菌,在培养基和发酵条件优化、代谢途径分析方面开展研究,研究结果如下:(1)考察了培养基配方和发酵条件对l-苏氨酸合成的影响。对培养基进行了碳氮源筛选,其他营养因素的单因素试验,Plackett-Burman(PB)实验,筛选出甜菜碱盐酸盐和磷酸两个显著性因子。在20%的装液量、37℃、p H为7.0、接种OD值为0.5、接种量为1%条件下,摇瓶分批发酵产量为0.7 g·l。在5l发酵罐上对磷酸盐进行分批补料培养,在添加浓度为9.8 g·l磷酸时l-苏氨酸产量为71 g·l。(2)针对磷酸盐对大肠杆菌产l-苏氨酸的影响,进行了代谢流分析和代谢控制分析。基于流量平衡原则构建了l-苏氨酸代谢网络图,估算出不同磷酸盐浓度下代谢通量,并对关键节点葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、α-酮戊二酸三个节点进行了代谢流分析。采用基于主成分分析的代谢控制分析得到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(CCP=0.058)、丙酮酸激酶(CCP=0.068)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(CCP=0.11)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(CCP=-0.00523)、苹果酸脱氢酶(CCP=0.048)、己糖激酶(CCP=0.05)的控制系数,阐明了几种酶对l-苏氨酸代谢通量的影响和贡献。(3)在代谢物水平上,进行了基于代谢组学技术的差异代谢途径分析和关键潜在生物标志物的筛选。对实验菌YQ001和对照菌W3110进行GC-MS分析。结果表明试验菌中的副产物氨基酸浓度相对较低,l-苏氨酸产量相对较高。主成分分析表明两株菌在代谢水平上存在显著差异。基于差异代谢物得分标记图,筛选获得了三个主要潜在生物标记物,肌醇、谷氨酸和柠檬酸。(4)基于代谢流分析、代谢控制分析和代谢组学分析结果,对某些关键途径、关键酶和生物标志物进行代谢调控。结果表明添加甘氨酸、硫酸锰、硝酸钠等均有助于l-苏氨酸产量提升,尤其是添加肌醇(0.1 g·l)、谷氨酸钠(5 g·l)时l-苏氨酸产量比对照提高1.86-4.9倍。在分批补料发酵过程中,以优化后的培养基配方进行发酵,l-苏氨酸产量达到77 g·l,相比于利用优化前的发酵培养基l-苏氨酸的产量提高了10%。

关键词：大肠杆菌 l-苏氨酸发酵优化代谢流分析代谢组学代谢调控

阻断大肠杆菌TWF001菌毛合成以提高l—苏氨酸产量

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阻断大肠杆菌TWF001菌毛合成以提高L—苏氨酸产量

作者：宫登科江南大学

学位级别：硕士

大肠杆菌菌毛不仅在生物合成过程中消耗大量的能量和物质,而且在生物膜的形成中起着至关重要的作用。因此,阻断菌毛生物合成有利于节省发酵过程中的底物和能量,从而促进大肠杆菌中氨基酸的合成。大肠杆菌中有12个负责菌毛生成和组装的伴... 详细信息

大肠杆菌菌毛不仅在生物合成过程中消耗大量的能量和物质,而且在生物膜的形成中起着至关重要的作用。因此,阻断菌毛生物合成有利于节省发酵过程中的底物和能量,从而促进大肠杆菌中氨基酸的合成。大肠杆菌中有12个负责菌毛生成和组装的伴侣-引座子(Chaperone-usher,CU)系统,本研究从一株l-苏氨酸高产菌株TWF001出发,通过对12个CU菌毛合成基因簇进行删除,阻断其菌毛生物合成,最终l-苏氨酸产量得到提高。(1)在TWF001中分别敲除Ycb、Yad、Yde、Yeh、Yqi、Yra、Yfc、Type 1、Yhc、Sfm、Mat和Ybg基因簇,获得突变菌株TWK001-TWK012,发现这些突变菌中l-苏氨酸产量均有不同程度提高。TWK012在摇瓶发酵36 h后,l-苏氨酸产量为12.4 g·l,转化率为0.31 g·g葡萄糖。(2)在TWK001中同时敲除多个CU菌毛合成基因簇,筛选出l-苏氨酸产量最高的菌毛突变菌株TWK021,l-苏氨酸产量达到15.75 g·l,生产效率为0.438 g·l·h。转化率为0.298 g·g葡萄糖,比TWK012增加了27%。(3)通过优化发酵培养基中硫酸铵和葡萄糖浓度,使TWK021中l-苏氨酸产量提高到17 g·l,生产效率为0.472 g·l·h。通过分批补料发酵,TWK021在发酵48 h后l-苏氨酸最高产量为62.7 g·l,生产效率为1.493 g·l·h,转化率为0.427 g·g葡萄糖,比TWF001提高了17.1%。(4)在大肠杆菌TWF001中敲除运动性和生物膜形成相关的基因nlp E、csr B和qse BC后,l-苏氨酸产量在摇瓶发酵36 h后达到17.9 g·l,生产效率为0.497 g·l·h,转化率达到0.445 g·g葡萄糖,比出发菌株TWF001提高了55.7%。但在菌毛突变菌株TWK021中敲除nlp E、csr B和qse BC,l-苏氨酸产量未见明显提升。

关键词：大肠杆菌 l-苏氨酸菌毛伴侣-引座子系统生物膜

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代谢工程改造大肠杆菌生产l-苏氨酸

代谢工程改造大肠杆菌生产L-苏氨酸

作者：杨豪江南大学

学位级别：硕士

l-苏氨酸属于人体九种必需氨基酸之一,广泛应用于饲料、食品、医药等领域。随着对大肠杆菌(Escherichia coli)中l-苏氨酸合成机制的深入了解,基于代谢工程改造大肠杆菌生产l-苏氨酸受到各国学者的青睐。大肠杆菌生物合成l-苏氨酸的代谢... 详细信息

l-苏氨酸属于人体九种必需氨基酸之一,广泛应用于饲料、食品、医药等领域。随着对大肠杆菌(Escherichia coli)中l-苏氨酸合成机制的深入了解,基于代谢工程改造大肠杆菌生产l-苏氨酸受到各国学者的青睐。大肠杆菌生物合成l-苏氨酸的代谢途径包括:葡萄糖糖酵解、三羧酸循环和l-苏氨酸合成。本研究以大肠杆菌菌株XQ-12为出发菌株,结合CRISPR-Cas9基因编辑技术,分析l-苏氨酸合成途径中的关键酶的反馈抑制作用、优化代谢途径中关键基因、减少支路代谢等系统代谢工程策略,逐步提高l-苏氨酸的产量。主要研究结果如下:(1)调控主要代谢途径:结合CRISPR-Cas9基因编辑技术,用较强的Ptrc启动子取代thrA天然启动子,并在假基因位点rpnD增加其在XQ-12基因组上的拷贝数增加l-天冬氨酸向l-苏氨酸的代谢通量。与原菌株XQ-12相比,菌株XQ-12.1在摇瓶发酵中的l-苏氨酸产量增加了 0.4倍(从9.5 g·l-1到13.2 g·l-1)。(2)增加前体物质合成:为了增加草酰乙酸的供应,在菌株XQ-12.1中过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。观察到菌株XQ-12.1/pEC-XK99E-ppc产量有所下降后,用Ptrc启动子替换基因ppc的天然启动子,构建XQ-12.1 Pppc::Ptrc菌株,即菌株XQ-12.2。菌株XQ-12.2的l-苏氨酸产量比XQ-12.1高6.8%,达到14.1 g·l-1,进一步提高了 l-苏氨酸产量。(3)减少碳源溢流:对糖酵解途径进行改造,对其关键酶基因pfkA和pykF进行基因敲除,获得菌株XQ-12.3。摇瓶发酵菌株XQ-12.3的l-苏氨酸产量(19.3 g·l-1)明显高于菌株XQ-12.2(14.1g·l-1)。在菌株XQ-12.3基因组中敲除基因crr,摇瓶发酵观察乙酸生成量及l-苏氨酸产量。敲除l-苏氨酸分解途径的关键基因tdh,获得菌株XQ-12.4。通过摇瓶发酵,菌株XQ-12.4的l-苏氨酸产量达到23.8 g·l-1。(4)发酵条件优化:在单因素实验的基础上,使用Box-Behnken Design(BBD)进行响应面设计优化培养基组分,得到菌株XQ-12.4发酵培养基成分的最佳参数水平;对菌株XQ-12.4发酵条件进行优化,获得最佳培养条件:pH 7.1、种龄14 h、接种量8%。(5)5 l发酵罐培养:对重组菌株XQ-12.4在上述优化条件下进行5 l发酵罐补料分批发酵。发酵结果显示,发酵36 h后,菌株XQ-12.4的l-苏氨酸产量达到131.20 g·l-1,产率为 3.64 g.l-1·h-1。本研究对l-苏氨酸生产菌株进行代谢改造以及发酵条件的优化,提升了菌株的产l-苏氨酸能力,对工业化生产l-苏氨酸具有一定的参考意义。

关键词： l-苏氨酸大肠杆菌代谢工程天冬氨酸激酶Ⅰ 响应面法

含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌l-苏氨酸积累的影响

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微生物学报 2009年第5期49卷 591-596页

作者：张雪闫继爱于雷张国强张芸陈宁温廷益天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院微生物研究所北京100101

【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对l-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrlp、... 详细信息

【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对l-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrlp、编码前导肽基因thrl以及thrA、thrB、thrC基因,通过重叠延伸PCR的方法对thrA基因定点突变,解除苏氨酸对它的反馈抑制,构建出重组表达质粒pWYE112和pWYE134,5l发酵实验测定l-苏氨酸的产量。【结果】经5l发酵罐发酵产酸实验,W3110的l-苏氨酸产量为0.036±0.004g/l,携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110菌株l-苏氨酸产量为2.590±0.115g/l,质粒上thrA解除反馈抑制后,l-苏氨酸的产量增加到9.223±1.279g/l。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使l-苏氨酸积累,进一步解除thrA基因的反馈抑制,可以增强l-苏氨酸积累的效果,为l-苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。

关键词： l-苏氨酸重叠延伸PCR 大肠杆菌发酵定点突变