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l-硒代蛋氨酸的合成与工艺优化

L-硒代蛋氨酸的合成与工艺优化

作者：戴扬晓暨南大学

学位级别：硕士

l-硒代蛋氨酸（l-Selenomethionine,l-SeMet）广泛存在于植物、动物和真菌中,但因为含量较低,无法满足人们日益增长的补硒需求。化学合成制备l-硒代蛋氨酸是解决当前补硒缺口的最有效方法,但目前报道的合成工艺因为环保或效率的原因,仅... 详细信息

l-硒代蛋氨酸（l-Selenomethionine,l-SeMet）广泛存在于植物、动物和真菌中,但因为含量较低,无法满足人们日益增长的补硒需求。化学合成制备l-硒代蛋氨酸是解决当前补硒缺口的最有效方法,但目前报道的合成工艺因为环保或效率的原因,仅停留在实验室阶段。因此,探索适合工业化生产l-SeMet的工艺路线是当务之急。本文在考察已有合成方法的基础上,优选出了一条适合工业化生产l-SeMet的制备方案:1)以碘甲烷/硫酸二甲酯为甲基化试剂与l-蛋氨酸反应得到锍鎓盐,再由碳酸氢钠热裂解得到l-高丝氨酸盐酸盐。优化后的工艺条件为:（1）碘甲烷合成法:n（l-蛋氨酸）∶n（碘甲烷）∶n（碳酸氢钠）=5∶10∶8,以水为溶剂,反应温度90℃,反应时间10 h;（2）硫酸二甲酯合成法:n（l-蛋氨酸）∶n（硫酸二甲酯）∶n（碳酸氢钠）=10∶19∶18,以水为溶剂,反应温度90℃,反应时间10 h,最高产率分别为71.61%和66.83%;2)将l-高丝氨酸盐酸盐与氢溴酸乙酸反应得到l-溴代高丝氨酸溴酸盐。优化后的合成工艺条件为∶n（l-高丝氨酸盐酸盐）∶n（氢溴酸）=1.0∶3.1,反应温度90℃,反应时间12 h,最高产率为77.72%;3)将硒粉和三乙酰氧基硼氢化钠/次硫酸氢钠甲醛反应得到二硒化二钠,再与l-溴代高丝氨酸溴酸盐反应得到l-硒代高胱氨酸。经优化后的工艺条件为:（1）三乙酰氧基硼氢化钠法:n（硒粉）∶n（NaOH）∶n（三乙酰氧基硼氢化钠）∶n（l-溴代高丝氨酸溴酸盐）=27∶52∶13∶10,制备二硒化二钠反应温度为25℃,反应时间为40 min;（2）次硫酸氢钠甲醛法:n（硒粉）∶n（NaOH）∶n（次硫酸氢钠甲醛）∶n（l-溴代高丝氨酸溴酸盐）=18∶50∶11∶10,制备二硒化二钠反应温度为60℃,反应时间为1 h;最终产率分别为62.42%和43.33%;4)l-硒代高胱氨酸与三乙酰氧基硼氢化钠常温反应,再和碘甲烷甲基化反应得到l-硒代蛋氨酸。优化后的工艺条件为:n（l-硒代高胱氨酸）∶n（NaOH）∶n（三乙酰氧基硼氢化钠）∶n（CHI）=10∶92∶34∶20,以水溶液为溶剂,反应温度为25℃,加入三乙酰氧基硼氢化钠后搅拌10 min后加入碘甲烷乙醇溶液,冷水浴下搅拌5 min析出固体,最终可获得最高产率为79.50%。

关键词：含硒氨基酸 l-硒代蛋氨酸二硒化二钠合成工艺

l-硒代蛋氨酸对氨气诱导猪气管炎症损伤的保护效应研究

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L-硒代蛋氨酸对氨气诱导猪气管炎症损伤的保护效应研究

作者：王欢东北农业大学

学位级别：硕士

氨气是规模化猪场中首要的环境污染物,其浓度过高会给育肥猪和工作人员的健康带来严重的影响。气管作为抵御外界有害气体进入的第一道防线,会直接受到氨气的刺激。目前关于氨气损伤育肥猪气管的分子机制尚不清楚。硒是动物体内必需的微... 详细信息

氨气是规模化猪场中首要的环境污染物,其浓度过高会给育肥猪和工作人员的健康带来严重的影响。气管作为抵御外界有害气体进入的第一道防线,会直接受到氨气的刺激。目前关于氨气损伤育肥猪气管的分子机制尚不清楚。硒是动物体内必需的微量元素,可以缓解环境污染物引起的氧化应激,拮抗有毒物质对机体造成的损伤。l-硒代蛋氨酸作为一种重要的有机硒源,有较高的生物利用率和安全性。因此,本研究模拟了畜牧生产中猪舍内的高氨环境,建立育肥猪氨气中毒模型并开展l-硒代蛋氨酸干预实验。本试验将24只125日龄育肥猪随机分为四组,即对照组、硒组、氨气组和氨气+硒组,通过转录组测序和蛋白组测序对氨气损伤猪气管的毒性机制进行初步评估,并在此基础上,运用病理组织学观察、电感耦合等离子体质谱法、荧光标记、免疫组化、q RT-PCR和Western blot等技术手段探讨l-硒代蛋氨酸对氨气毒性的缓解效应及分子机制。本研究为进一步丰富氨气的毒理学机制提供理论借鉴,同时也为饲料开发中筛选降低氨毒性的活性物质提供科学指导。研究结果表明:(1)氨气暴露能影响猪气管组织转录谱和蛋白谱的变化。差异显著的基因与炎症,氧化应激,微管活动和SlC家族有关。差异显著的蛋白主要富集在免疫、蛋白质合成、代谢和程序性坏死信号通路中。(2)氨气暴露引起了猪气管组织显微结构和超微结构的改变,表现为气管上皮细胞脱落,淋巴细胞浸润,气管细胞膜破裂,核仁消失,内质网肿胀、扩张,纤毛倒伏、排列混乱以及黏液附着,而添加硒以后气管病变程度明显减轻。(3)氨气暴露促进猪气管组织MDA和ROS含量的产生,抑制抗氧化酶SOD、GSH-Px活性和GSH含量,表明过量氨气能导致猪气管组织发生氧化应激,l-硒蛋氨酸的添加能够拮抗氨气诱导的氧化应激。(4)氨气暴露降低了猪气管组织HO-1和IκB-α的表达,增加了NF-κB、IKKβ、i NOS、COX-2、PTGEs和NlRP3的含量,表明氨气暴露可激活NF-κB信号转导途径并促进炎症反应,而补硒能有效缓解氨气诱导的上述炎症基因表达的变化。(5)高浓度氨气可通过增加TNF-α、Il-1β和Il-6的m RNA水平和降低IFN-γ的m RNA水平导致猪气管组织细胞因子失衡,而添加硒以后以上指标的变化程度有所缓解。(6)氨气暴露显著上调了MAPK通路(ERK、JNK和p38)、程序性坏死通路(RIPK1、RIPK3、MlKl、Caspase-8),和热休克蛋白(HSP40、HSP60、HSP70、HSP90)相关基因的表达,表明氨气激活MAPK通路,促进HSP的表达并触发细胞发生程序性坏死,而l-硒蛋氨酸能恢复以上基因的表达,缓解氨气的毒性作用。综上所述,气管是氨气毒性的靶器官。氨气能引起猪气管细胞内ROS蓄积和氧化应激,进而激活RIPK1/RIPK3/MlKl通路诱发程序性坏死,并通过免疫失衡激活MAPKs/NF-κB途径促进炎症反应。而l-硒代蛋氨酸的添加能通过调控氧化应激介导的细胞程序性坏死抑制高氨环境引起的猪气管组织炎症损伤,拮抗氨气对猪气管的毒性作用。

关键词：氨气 l-硒代蛋氨酸程序性坏死氧化应激炎症反应

l-硒代蛋氨酸缓解氨暴露诱发猪肠道损伤的作用机制研究

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L-硒代蛋氨酸缓解氨暴露诱发猪肠道损伤的作用机制研究

作者：张新新东北农业大学

学位级别：硕士

氨气是畜禽生产中公认的主要有害气体。肠道作为营养物质最大的消化吸收器官,也是氨中毒的靶器官之一。然而,氨中毒对肠道的潜在毒性机制仍不清楚。硒作为对机体十分重要的必须微量元素,能够拮抗应激源带来的氧化损伤。l-硒代蛋氨酸是... 详细信息

氨气是畜禽生产中公认的主要有害气体。肠道作为营养物质最大的消化吸收器官,也是氨中毒的靶器官之一。然而,氨中毒对肠道的潜在毒性机制仍不清楚。硒作为对机体十分重要的必须微量元素,能够拮抗应激源带来的氧化损伤。l-硒代蛋氨酸是重要的有机硒来源之一,其优点是生物利用率高且安全高效。尽管环境氨暴露与肠道介质的变化有关,但l-硒代蛋氨酸对氨气诱导的肠道细胞生理反应的调节机制的影响尚未被报道。为了综合分析氨气的毒性作用及其机制,筛选出有效的解毒物质,本研究建立了多维度氨气中毒模型进行试验研究,从体内、体外两个维度进行l-硒代蛋氨酸干预氨中毒实验。在体内试验中,选用24只125日龄育肥猪随机分为四组,即对照组、硒组、氨气组和氨气+硒组。在体外试验中,进行IPEC-J2细胞系培养,共设置两个模型,每个模型六组。模型一——程序性坏死抑制模型:分为对照组、硒组、氯化铵组、氯化铵+硒组、氯化铵+NAC组、氯化铵+Nec-1组;模型二——铁死亡抑制模型:分为对照组、硒组、氯化铵组、氯化铵+硒组、氯化铵+Ml334组、氯化铵+Fer-1组。在此分组的基础之上,首先对氨中毒的小肠组织和IPEC-J2细胞进行病理学初步评估,之后运用多种前沿实验技术,从氧化应激、程序性坏死、铁死亡、Nrf2信号通路、Th1/Th2失衡和炎症等角度对氨暴露诱发肠道损伤的分子作用机制以及l-硒代蛋氨酸的保护机制进行了探索和验证。本研究不仅揭示了氨毒性的新机制,丰富了氨的毒理学理论,而且为阐明l-硒代蛋氨酸减轻氨诱导肠毒性的分子机制指明了方向。同时,本研究还提高了家畜的机体免疫力、生产性能以及经济效益,为健康绿色养殖提供了保障,为饲料开发提供了方向。研究结果表明:(1)氨气暴露增加了猪小肠组织和IPEC-J2细胞内的MDA和ROS水平,降低了抗氧化酶SOD、GSH-Px活性和GSH含量,显著改变了Nrf2信号通路(Keap1、Nrf2、HO-1)、程序性坏死(RIPK1、RIPK3、MlKl、Caspase-8)、炎症因子(IFN-γ、IκBα、Il-2、TNF-α、Il-4、Il-6、Il-1β、NF-κB p65、IKKβ、i NOS、COX-2)、肠道紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)等相关基因的表达,表明氨暴露通过引起猪肠道氧化应激,抑制Nrf2/Keap1/HO-1信号通路,诱发程序性坏死,进而介导肠道炎症,破坏肠道屏障。(2)氨气暴露上调猪小肠组织和IPEC-J2细胞内的铁、ROS和lPO水平,抑制Nrf2通路,显著改变了铁死亡(TFR-1、FPN-1、FTH1、SlC7A11、GPX4、ACSl4)和肠道紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)等相关基因的表达,表明氨暴露可导致猪肠道细胞内铁过载、脂质过氧化以及ROS积累,通过调控Nrf2通路进而诱导细胞铁死亡,最终损伤肠道屏障。(3)l-硒代蛋氨酸可以下调猪小肠组织和IPEC-J2细胞内的MDA、ROS和铁水平,增加抗氧化酶SOD、GSH-Px活性和GSH含量,部分复原Nrf2信号通路、程序性坏死、铁死亡、炎症因子、肠道紧密连接蛋白等相关基因的表达,表明l-硒代蛋氨酸的添加能有效减轻氨气诱导的肠道氧化应激,并通过调控lPO和ROS水平以及Nrf2/Keap1/HO-1通路部分拮抗细胞程序性坏死和铁死亡,从而减轻氨暴露引起的猪肠道损伤。综上所述,肠道是氨发挥毒性的靶器官之一,氨暴露可导致猪小肠组织和IPEC-J2细胞的氧化应激、脂质过氧化以及ROS过度积累,通过调控Nrf2通路,从而诱发程序性坏死及铁死亡,并以炎症反应为靶点导致肠道紧密连接被破坏,进而损伤肠道屏障。l-硒代蛋氨酸通过调控氧化应激/铁死亡/程序性坏死/炎症轴从而有效减轻氨暴露所致的肠道损伤,进而拮抗氨的肠道毒性。本研究不仅揭示了氨毒性的新机制,还丰富了氨的毒理学理论,同时也为阐明l-硒代蛋氨酸减轻氨诱导的肠毒性分子机制提供了理论依据。

关键词：氨气 l-硒代蛋氨酸氧化应激程序性坏死铁死亡肠道损伤

第二代抗癌药物卡铂与l-硒代蛋氨酸和l-蛋氨酸的相互作用研究

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无机化学学报 2002年第1期18卷 37-40页

作者：刘琴林骏张俊勇朱龙根郭子建南京大学配位化学国家重点实验室 2南京经济学院食工系南京210003

The reactions of carboplatin ([Pt(NH3)2(CBDCA)], in which CBDCA is cyclobutane 1,1, dicarboxylate) with l selenomethionine (l Se MetH) and l methionine (l MetH) were investigated using electrospray mass spectroscopy (ESMS) and 2D HSQC NMR spectroscopy. The dominant products for both reactions are bis chelated complexes [Pt(l Se Met)2] and [Pt(l Met)2]. These results are different from those observed for the reactions of cisplatin ([PtCl2(NH3)]) with l Se MetH or l MetH, in which the main products are mono chelated complexes [PtCl(NH3)(l Se Met)] or [PtCl(NH3)(l Met)]. This work provides insights into the differences between cisplatin and carboplatin in their reactivity and mechanism of reaction.

关键词：卡铂 l-硒代蛋氨酸 l-蛋氨酸电喷雾质谱抗癌药物相互作用药理

N-酰基-l-硒代蛋氨酸衍生物的合成、细胞毒性评价及初步药动学研究

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N-酰基-L-硒代蛋氨酸衍生物的合成、细胞毒性评价及初步药动学研究

作者：唐灿武汉轻工大学

学位级别：硕士

硒元素是一种重要的微量元素,在各种生物体内发挥着不可替代的作用,它与生命体的各种生理功能有着非常紧密的联系。20世纪中期以来,科学家们对于硒元素的探索越来越深入,人们意识到硒元素对于生物体的健康作用非常显著,有机硒产品的开... 详细信息

硒元素是一种重要的微量元素,在各种生物体内发挥着不可替代的作用,它与生命体的各种生理功能有着非常紧密的联系。20世纪中期以来,科学家们对于硒元素的探索越来越深入,人们意识到硒元素对于生物体的健康作用非常显著,有机硒产品的开发与研究也成为了一个热门的课题。硒代蛋氨酸是一种生物相容性较好的有机硒化物,具有广泛的应用前景。然而,硒代蛋氨酸结构简单,应用功能单一,限制了其诸多应用范围。本研究通过对硒代蛋氨酸进行化学修饰,既保留了硒代蛋氨酸的有机硒活性,又扩宽了硒代蛋氨酸在食品、医药、化妆品等领域的应用范围,为硒代蛋氨酸类有机硒化物的开发与应用提供一种新的思路与方法。本论文主要以l-硒代蛋氨酸为基础原料,通过l-硒代蛋氨酸与月桂酰氯和油酰氯的缩合反应和甲酯化反应,对l-硒代蛋氨酸进行结构修饰,得到N-酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯衍生物,通过核磁共振氢谱、碳谱以及二维核磁(HSQC、HMBC)谱图确证,并对其主要位置的C、H原子信号进行了详尽的归属。通过对合成反应过程中关键的Schotten-Baumann缩合反应步骤进行正交工艺优化,得出最佳合成反应工艺条件:N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸的最佳反应条件为反应温度为0℃,反应p H为9,反应时间4 h,n(氨基酸):n(月桂酰氯)为2:1,在此反应条件下,平均产率为76.39%。N-油酰基-l-硒代蛋氨酸最佳反应温度为25℃,反应p H为11,反应时间6 h,n(氨基酸):n(月桂酰氯)为2:1,平均反应产率为69.12%。对合成的两种化合物进行了细胞毒性性评价,通过MTT比色法表述两种化合物对于细胞活性的影响,通过试验确证N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯和N-油酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯对人体正常肝细胞(Hl-7702)和大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)均无显著的毒性。当两种化合物浓度在0-1920μmol/l时,两种细胞存活率均在75%以上,表明化合物的细胞毒性较小。通过细胞毒性评价确认目标化合物无明显毒性后,选取N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯进行大鼠血浆药代动力学初步评价,通过开发建立N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯的定量方法,考察大鼠灌胃给药N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯后,大鼠体内血药浓度的变化情况和主要的药代动力学参数。建立的方法选择性强、线性范围宽(80～20000 ng/m l)、灵敏度较好(llOQ为80 ng/m l)。通过分析得出N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯在雌雄个体之间,存在着明显的吸收差异性,雄性大鼠的吸收速度和吸收量均大于雌性大鼠,并且药物在大鼠血浆达峰较快,半衰期较短,药物进入体内后,主要富集与各个脏器和组织内。通过对N-月桂酰基-l-硒代蛋氨酸甲酯的进行初步的药代动力学评价,为相关或类似的硒代氨基酸衍生物的研究和生物学评价提供思路和相关的探究。

关键词：硒 l-硒代蛋氨酸合成细胞毒性评价药代动力学

微生物酶法制备手性N-BOC-l-高丝氨酸内酯及其在合成l-硒代蛋氨酸中的应用

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微生物酶法制备手性N-BOC-L-高丝氨酸内酯及其在合成L-硒代蛋氨酸...

作者：吴冬梅浙江工业大学

学位级别：硕士

l-高丝氨酸内酯是一种重要的非天然手性α-氨基酸内酯,它是一种重要的化工原料和医药中间体,广泛应用于手性药物的合成。本论文的主要目标在于研究利用微生物酯水解酶拆分制备l-高丝氨酸内酯及衍生物,应用于l-硒代蛋氨酸的合成。首先,... 详细信息

l-高丝氨酸内酯是一种重要的非天然手性α-氨基酸内酯,它是一种重要的化工原料和医药中间体,广泛应用于手性药物的合成。本论文的主要目标在于研究利用微生物酯水解酶拆分制备l-高丝氨酸内酯及衍生物,应用于l-硒代蛋氨酸的合成。首先,本论文以N-Boc-Dl-高丝氨酸内酯为底物从土壤中筛选到130株对N-Boc-高丝氨酸内酯有选择性水解活力的菌株,其中大多数为(R)-构型酯水解酶产生菌,少数为(5)-构型酯水解酶产生菌,实验筛选获得一株立体选择性较高的(R)-构型酯水解酶产生菌株作为深入研究的目标菌株,通过形态学观察和16SrDNA序列分析,确定其为嗜烟节杆菌,将其命名为Arthrobacter nicotinovorans WYG0001。接着,通过单因素实验,对菌株Arthrobacter nicotinovorans WYG001的发酵及产酶条件进行了较为详细的研究,最后确定该菌株的最佳培养基成分为:酵母膏1.2%,乳糖1.0%,硫酸镁2 mmol/l,磷酸二氢钾1mmol/l,氯化钠1.0%,培养基初始pH为7.0;121℃灭菌20min;菌株的最佳培养条件是30℃,200rmp于30l发酵罐中培养24h。发酵生物量从最初的2.06g/l提高到了 8.55g/l,是优化前的4倍;所得的菌体的酶活力从3.48 U/l提高到75.55 U/l,是优化前的22倍,底物N-Boc-l-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s也从最初的7.67%提高到82.98%,转化率C由最初的4.9%提高到47.9%。然后,对全细胞催化剂Arthrobacter nicotinovorans WYG001水解动力学拆分N-Boc-Dl-高丝氨酸内酯的反应条件进行了详细的研究,最终确定其最优反应条件为:以DMSO(底物/DMSO=1:2,w/v)作助溶剂,在0.1 M,pH 7.2的磷酸钾缓冲液中,底物与菌粉的比为1:2(底物浓度为 2.5%(125 mmol/l),全细胞催化剂Arthrobacter nicotinovorans WYG001 的浓度为 5%(0.05 g/ml)),反应温度为 30℃,200 rpm 水浴反应11h,可获得光学纯的N-Boc-l-高丝氨酸内酯(e.e.s>99.9%),转化率C为51.09%,得率达到48.39%,对映体选择率E值为278。Arthrobacter nicotinoorans WYG001冻干菌粉在重复使用8次后,其催化活性仍保持初始活性的85%。最后,本论文将动力学拆分反应体系放大到200 ml,11 h后反应完全,通过对反应液的分离纯化,最后得到光学纯的N-Boc-l-高丝氨酸内酯2.4 g,产率为48%。经手性气相色谱分析确定其对映体过量值(e.e.s)在99%以上;然后,以微生物酶法选择性催化水解制备得到的光学纯的N-Boc-l-高丝氨酸内酯为起始底物,通过两或三步化学反应成功合成得到了光学纯的l-硒代蛋氨酸,并对l-硒代蛋氨酸进行结构鉴定。

关键词： N-Boc-l-高丝氨酸内酯酯酶立体选择性水解动力学拆分 l-硒代蛋氨酸