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A kunitz trypsin inhibitor from chickpea (<i>Cicer arietinum</i>L.) that exerts an antimicrobial effect on Fusarium oxysporum ***. ciceris

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Agricultural Sciences 2013年第11期4卷 585-594页

作者： Meera Nair Sardul Singh Sandhu Fungal Biotechnology and Invertebrate Pathology Laboratory Department of Biological Sciences Rani Durgavati University Ja-balpur India

Fusarium oxysporum ***. ciceris (Foc) is one of the most important fungal pathogens of chickpea and is regarded as a constant threat in tropical and subtropical countries. In order to correlate Fusarium wilt resistance/susceptibility in Cicer arietinum to the presence or absence of trypsin inhibitor (TI) in the crude extract, trypsin inhibitory assay (TIA) and in vitro activity of TI against Foc were studied. In the present study, a 20 kDa trypsin inhibitor was purified from Fusarium wilt resistant cultivar (viz. JG 2001-12) by ammonium sulfate precipitation, dialysis and chromatographies with Sephadex G-100 and Diethyl aminoethyl cellulose (DEAE-cellulose-52) ion-exchange column. Results of pathogenecity assay were found to be in correlation to the trypsin inhibitor assay where the Fusarium wilt resistant cultivar showed high trypsin inhibitory activity (99%) in the presence of trypsin enzyme using both natural and synthetic substrates. Preliminary studies using crude extracts of JG 2001-12 showed a decrease in radial growth of Foc. A 45%-82% reduction in conidium germination at 20 μg·mL-1?Cicer arietinum trypsin inhibitor (CaTI) concentration was observed, thereby, indicating the use of CaTI in suppression of pathogen and in its deployment through transgenic plants for the management of Fusarium wilt.

关键词： Cicer arietinum Fusarium Wilt kunitz Proteinase Inhibitor Trypsin Inhibitor

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kunitz型胰蛋白酶抑制剂的研究进展

中国生化药物杂志 2012年第3期33卷 316-319页

作者：罗玉娇李滨舒衡平蒋立平中南大学基础医学院医学寄生虫学系湖南长沙410078

kunitz型胰蛋白酶抑制剂属于典型丝氨酸蛋白酶抑制剂,其生理功能至少包括了保护储存蛋白、调节内源蛋白酶的活性、保护个体免受昆虫和病原体的侵害、抑制癌细胞侵袭扩散、抗炎、抗真菌等作用。并已经应用到了抗虫性转基因植物和临床疾... 详细信息

kunitz型胰蛋白酶抑制剂属于典型丝氨酸蛋白酶抑制剂,其生理功能至少包括了保护储存蛋白、调节内源蛋白酶的活性、保护个体免受昆虫和病原体的侵害、抑制癌细胞侵袭扩散、抗炎、抗真菌等作用。并已经应用到了抗虫性转基因植物和临床疾病治疗中。

关键词： kunitz 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶

kunitz型和Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化及鉴定

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Kunitz型和Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化及鉴定

作者：宋鑫秀吉林农业大学

学位级别：硕士

大豆中含有很多抗营养因子，其中，最主要的是大豆胰蛋白酶抑制因子（STI），它可影响蛋白质的消化率和利用率，并导致动物的多种不良生理反应。研究表明，在大豆中至少存在5种胰蛋白酶抑制因子，然而，目前仅报道了库尼兹型胰蛋白酶抑... 详细信息

大豆中含有很多抗营养因子，其中，最主要的是大豆胰蛋白酶抑制因子（STI），它可影响蛋白质的消化率和利用率，并导致动物的多种不良生理反应。研究表明，在大豆中至少存在5种胰蛋白酶抑制因子，然而，目前仅报道了库尼兹型胰蛋白酶抑制因子（KTI）和鲍曼-伯克型胰蛋白酶抑制因子（BBI）两种类型抑制因子的分离方法。从实验操作和效果来看，国内外已经报道的STI分离纯化方法，不是分离过程繁琐就是纯化倍数低。因此，本研究以大豆种子为原料，探索既高效、便捷又效果好的KTI和BBI分离纯化方法，为今后对二者的进一步深入研究奠定理论基础。以大豆为原料，经过粗提液的制备和层析等方法研究一种纯化效率较高的kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，并与一步法进行比较分析。选用吉育52大豆为原料，经研磨、脱脂、酸抽提、热变性、35%-75%(NH4)2SO4分步沉淀等制备KTI粗提液，再采用离子交换、亲和层析、葡聚糖凝胶等多步法和亲和层析一步法分别进行KTI的纯化并进行SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF检测及N-端氨基酸测序以鉴定其纯度。结果表明，10g大豆通过多步法纯化得到纯化倍数为72.39倍的KTI，而通过一步法纯化得到的纯化倍数为28.85倍。这两种方法经SDS-PAGE电泳检测均得到单一条带，其近似分子量为19.4kD。对多步法分离纯化得到的KTI作进一步的纯度分析，经MALDI-TOF检测可知，KTI的精确分子量为22907.51Da;N-端氨基酸测序结果显示，该KTI与多种kunitz家族胰蛋白酶抑制因子有较高的同源性。对上述结果进行比较分析，我们发现多步法的纯化倍数要远高于一步法，表明多步法要优于一步法;而且纯化得到的KTI与多种kunitz家族胰蛋白酶抑制因子有较高的同源性。以大豆种子为原材料，经过粉碎、正己烷脱脂、50%乙醇抽提、65℃热变性、等电点沉淀和丙酮沉淀得到BBI粗提物。粗提液先后经过DEAE-52离子交换层析和胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B亲和层析得到BBI纯品，之后，进行尿素SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF检测及N-端氨基酸测序以鉴定其纯度。结果表明，经过粗提液制备、离子交换层析和亲和层析后，BBI的比活力为882.31U·mg-1，比原来粗品17.62U·mg-1的比活力大约提高了50倍，活性回收达到了69.34%。SDS-PAGE电泳结果显示BBI的近似分子量为9.8kD，经MALDI-TOF检测BBI的精确分子量为8837.46Da，N-端氨基酸测序结果显示，BBI与多种Bowman-Birk家族胰蛋白酶抑制因子具有较高的同源性，其中，与Glycine max、Glycinesoja、Vigna marina、Phaseolus grayanus及mung bean的同源性分别为80%、80%、73%、72%和60%，说明纯化效果理想。

关键词： kunitz Bowman-Birk 大豆胰蛋白酶抑制因子分离纯化鉴定

虎纹捕鸟蛛kunitz型毒素基因的分子改造和表达

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中国病原生物学杂志 2016年第8期11卷 677-684页

作者：罗玉娇舒衡平李滨蒋立平中南大学基础医学院医学寄生虫学系湖南长沙410078 中南大学湘雅二医院血液内科分子血液病研究室湖南长沙410011 中南大学药学院药理学系湖南长沙410013

目的构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-XI),解决HWTX-XI来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11c40突变体的筛选和治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定基础。方法用PCR定... 详细信息

目的构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-XI),解决HWTX-XI来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11c40突变体的筛选和治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定基础。方法用PCR定点突变的方法突变HW11c40相关氨基酸残基,构建HW11c40突变体。HW11c40突变体和HWTX-XI基因经PCR扩增后插入到pET-40b(+)载体,基因5'端插入肠激酶切割位点,再重组到大肠埃希菌BL21(DE3)进行原核周质表达,获得相应的融合蛋白并进行SDS-PAGE鉴定,用镍柱纯化融合蛋白。融合蛋白用肠激酶酶切,释放出的目的蛋白用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定,用镍柱分离目的蛋白,进行高效液相色谱进行进一步分离纯化后作质谱鉴定。对HW11c40突变体和HWTX-XI的表达时间、温度和IPTG浓度进行优化。结果成功获得HW11c40的4个突变体,并正确构建HW11c40突变体和HWTX-XI的原核表达载体。经SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE鉴定,重组质粒转化菌在无IPTG诱导的情况下成功表达所有HW11c40突变体和HWTX-XI的融合蛋白,经肠激酶酶切均获得对应的目的蛋白,其中HWTX-XI表达量为3.4mg/L。结论成功构建出HW11c40突变体和HWTX-XI的重组质粒并在原核细胞内高效表达出相应的目的蛋白,开辟了基因工程表达HWTX-XI的新途径,同时解决了HW11c40改造后毒素获取难题,突破了整个系列研究的瓶颈,为突变体的筛选及治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定了基础。

关键词：虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ HW11c40突变体胰蛋白酶抑制活性 kunitz 原核周质表达

蜱源含kunitz功能域的丝氨酸蛋白酶抑制分子研究进展

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动物医学进展 2013年第11期34卷 97-101页

作者：乔瑞琼周金林上海师范大学生命与环境科学学院上海200234 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

蜱是地球上仅次于蚊子的第二大病原传播媒介,可引起人和动物多种疾病。控制蜱的传统方法是使用杀虫剂,但药物残留等问题日益突出,因此寻求更加健康环保的抗蜱方法迫在眉睫。蛋白酶水解反应参与生物体大多数生理活动,该反应的调节机制亦... 详细信息

蜱是地球上仅次于蚊子的第二大病原传播媒介,可引起人和动物多种疾病。控制蜱的传统方法是使用杀虫剂,但药物残留等问题日益突出,因此寻求更加健康环保的抗蜱方法迫在眉睫。蛋白酶水解反应参与生物体大多数生理活动,该反应的调节机制亦成为研究热点。kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制分子作为一种重要的蛋白酶水解反应调节物,与蜱的多项生理功能关系密切。论文对蜱源kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制分子的结构和功能加以论述,总结近年来的相关研究进展,以期为进一步研究提供参考。

关键词：蜱丝氨酸蛋白酶抑制分子 kunitz

捻转血矛线虫kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i2基因的特性研究

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捻转血矛线虫Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i2基因的特性...

作者：吴杰浙江大学

学位级别：硕士

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生在牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃当中的消化道线虫,感染后对宿主动物造成虚弱、贫血甚至死亡等危害,严重影响畜牧业发展,对畜牧业具有重大经济意义。早期抗线虫药物开发使得捻转血矛线虫... 详细信息

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生在牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃当中的消化道线虫,感染后对宿主动物造成虚弱、贫血甚至死亡等危害,严重影响畜牧业发展,对畜牧业具有重大经济意义。早期抗线虫药物开发使得捻转血矛线虫病得到一定控制,但随着药物不合理使用,耐药性虫株逐渐增多导致防治效果下降。线虫入侵宿主过程是生活史中的重要阶段,找寻在线虫入侵过程涉及的关键药物靶点,开发新型抗线虫药物,对于防治工作尤为重要。kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子在蠕虫入侵宿主过程中能够抵御宿主丝氨酸蛋白酶的降解作用,逃避宿主免疫反应,利于宿主体内寄生。因此,筛选出捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子相关基因,研究作用机制及相关功能,会对该病的防治提供新思路。本研究从捻转血矛线虫蛋白组学数据库中筛选出入侵过程中表达水平升高的蛋白酶抑制因子基因,从c DNA中进行扩增并命名为Hc-spi-i2,对基因结构、功能域及进化关系进行了预测和分析;制备多克隆抗体,进行了Hc-SPI-I2蛋白的雌虫组织定位观察,转染HEK 293T细胞观察亚细胞定位;通过酵母双杂交系统在绵羊血c DNA文库中筛选出与HcSPI-I2相互作用的绵羊GNB1蛋白,并通过免疫共沉淀及细胞共定位实验对互作关系进行验证;探究了Hc-SPI-I2蛋白、绵羊GNB1蛋白及两者共同对NLRP3炎性小体的影响。***-spi-i2基因特性分析及表达特性分析通过Worm Base Parasite网站获得筛选出的基因参考序列（Gene ID:HCON＿00133150）,通过分析可知其含有12个内含子,13个外显子。以*** ZJ株c DNA为模板,扩增获得Hc-spi-i2的CDS序列,长度为3108 bp,分析氨基酸序列可知存在1个信号肽和2个kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子功能域,对该功能域所在碱基序列截短扩增,长度为486 bp,用于后续实验研究。检索寄生虫中kunitz型功能域同源序列,通过MEGA X进行保守性分析,并且绘制进化树,可知kunitz型功能域较为保守。为研究Hc-SPI-I2表达特性,利用q RT-PCR检测Hc-spi-i2在捻转血矛线虫各个时期转录水平,发现在L3期至L4期转录水平显著升高,验证了最初蛋白组数据库的筛选依据。构建Hc-spi-486i2原核表达质粒,利用原核表达系统诱导表达蛋白,纯化鉴定后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western Blot验证多克隆抗体能够识别天然蛋白。利用多抗检测Hc-spi-486i2转录水平最高的雌虫中的Hc-SPI-486I2蛋白定位情况,结果表明其广泛分布于虫体肠道、性腺及皮下组织,且存在点状聚集。分析不同系统中表达情况,构建EGFP荧光标签真核表达质粒,转染HEK 293T细胞,观察细胞中定位情况,发现Hc-SPI-I2主要表达于HEK 293T的细胞质当中。本章研究通过对Hc-spi-i2基因特性的分析以及对Hc-SPI-I2蛋白表达特性分析,为后续实验研究奠定基础、提供方向。***-SPI-I2互作蛋白筛选及验证kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子在抵御宿主消化道丝氨酸蛋白酶方面起到重要作用,探究入侵宿主过程中Hc-SPI-I2蛋白与宿主蛋白间相互作用具有重要意义。为了探究未知互作蛋白,构建酵母Hc-SPI-I2诱饵蛋白质粒,采用酵母双杂交系统筛选方法,在绵羊血c DNA文库中筛选与之相互作用的蛋白。对筛选结果进行分析比对,获得9个互作蛋白序列,选择GNB1蛋白同源片段,通过NCBI网站进行序列分析,扩增GNB1基因,构建p GBKT7酵母质粒进行互作验证。构建两者不同荧光标签的真核表达质粒,转染HEK 293T细胞,发现在细胞中出现共定位情况,提供两者存在互作关系的支撑。构建两者分别带有Flag和HA抗体标签的质粒,进行免疫共沉淀实验,验证确定了Hc-SPI-I2与GNB1蛋白互作关系,且无非特异性结合。***中蛋白与宿主间互作蛋白的筛选及验证,提示了Hc-SPI-I2在入侵宿主过程中确实发挥了作用,为后续功能研究提供研究基础。3.蛋白相互作用对NLRP3炎性小体的影响捻转血矛线虫入侵宿主过程中会导致炎症反应发生,而炎性小体是在细胞中形成的多聚体蛋白质复合物,参与宿主机体对于病原的防御机制。在天然缺失NLRP3和ASC的HEK 293T细胞中重新构建NLRP3炎性小体体外模型用于后续探究。以经过LPS和ATP刺激的THP-1细胞c DNA为模板,对构建NLRP3炎性小体所需的4个基因进行扩增,获得Caspase-1、NLRP3、ASC和IL-1β的正确序列;通过对上述4个人源基因和绵羊基因功能域进行分析比对,可知NLRP3炎性小体在两物种间较为保守;构建上述

关键词：捻转血矛线虫 Hc-spi-i2 kunitz 蛋白互作 NLRP3炎性小体

饲喂有或无kunitz胰蛋白酶抑制因子基因表现的大豆对雏鸡生长和胰腺重量的影响

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饲料广角 1990年第3期 44-45页

作者：冯立志

饲养260只8～16日龄的雏鸡,用以测定有或无kunitz胰蛋白酶抑制因子基因表现的大豆的营养价值。用高压锅在121℃和1.1公斤/厘米~2的蒸汽压力下,使这两种大豆受到0、3、6、12、18和24分钟的六种热处理,

关键词：抑制因子胰蛋白酶 kunitz 胰腺大豆雏鸡

A locus on chromosome 20 encompassing genes that are highly expressed in the epididymis

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Asian Journal of Andrology 2007年第4期9卷 540-544页

作者： Ake Lundwall Department of Laboratory Medicine Lund University Clinical Chemistry University Hospital MAS Malmoe S-205 02Sweden

During liquefaction of the ejaculate, the semen coagulum proteins semenogelin I （SEMG1） and semenogelin Ⅱ （SEMG2） are degraded to low molecular mass fragments by kallikrein-related peptidase 3 （KLK3）, also known as prostate-specific antigen. Semenogelin molecules initiate their own destruction by chelating Zn^2＋ that normally would completely inhibit the proteolytic activity of KLK3. In a similar way, semenogelins might regulate the activity of kallikrein-related peptidases in the epididymis, something that might be of importance for the maturation of spermatozoa or generation of anti-bacterial peptides. Studies on the evolution of semen coagulum proteins have revealed that most of them carry an exon that displays a rapid and unusual evolution. As a consequence, homologous proteins in rodents and primates show almost no conservation in primary structure. Further studies on their evolution suggest that the progenitor of the semen coagulum proteins probably was a protease inhibitor that might have displayed antimicrobial activity. The semenogelin locus on chromosome 20 contains at least 17 homologous genes encoding probable protease inhibitors with homology to semen coagulum proteins. All of these are highly expressed in the epididymis where they, similar to the semenogelins, could affect the maturation of spermatozoa or display antibacterial properties. （Asian J Androl 2007 July; 9： 540-544）

关键词： antimicrobial inhibitor kunitz proteolysis semen semenogelin zinc whey acidic protein four disulphide core

Novel alleles among soybean Bowman-Birk proteinase inhibitor gene families

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Science China(Life Sciences) 2008年第8期51卷 687-692页

作者： WANG YuePing1,2, CHEN XiongTing2 & QIU LiJuan1 1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Key Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology(MOA)/Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 10008, China 2 Institute of Tropical Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement Key Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology (MOA)/Institute of Crop Science Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing China Institute of Tropical Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences Haikou China

Trypsin inhibitors have been found in various animals, plants and *** were two types of trypsin inhibitors in soybean including Bowman-Birk protease inhibitors(BBI) and kunitz in-hibitors(KTI).The different BBI genes from wild soybean(***) and cultivated soybean(***) formed a multigene *** constructed a cDNA library of cultivar 'SuiNong 14' seed at the R7 growth stage using the SMART *** contigs or singletons were highly homologous to soy-bean protease *** of 5, 35, 8 and 9 were highly homologous to BBI family members BBI-A1, BBI-A2, BBI-C and BBI-D, *** analyses showed there were novel allelic varia-tions among the 4 BBI members in SuiNong *** on the comparison of soybean seed cDNA li-braries from different developmental stages, it was apparent that the expression of trypsin inhibitors increased during seed development in *** analysis of BBI gene sequences among dicotyledonous and monocotyledonous plants demonstrated that these genes shared a common pro-genitor.

关键词： soybean trypsin inhibitor Bowman-Birk proteinase inhibitor kunitz trypsin inhibitor allelic variation