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重组疥螨翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）对ku812细胞脱颗粒的影响

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重组疥螨翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）对KU812细胞脱颗粒的影响

作者：徐紫伊四川农业大学

学位级别：硕士

疥螨病是一种顽固的、有传染性的人兽共患皮肤病,由疥螨(Sarcoptes scabiei)寄生于宿主皮肤表皮内而引起。疥螨的排泄分泌物会引起宿主表皮和真皮细胞发生病理反应,导致瘙痒、红肿、过敏性炎症等临床症状。翻译控制肿瘤蛋白(translation... 详细信息

疥螨病是一种顽固的、有传染性的人兽共患皮肤病,由疥螨(Sarcoptes scabiei)寄生于宿主皮肤表皮内而引起。疥螨的排泄分泌物会引起宿主表皮和真皮细胞发生病理反应,导致瘙痒、红肿、过敏性炎症等临床症状。翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一种新发现的寄生虫排泄分泌蛋白,已有研究证明部分寄生虫该蛋白能参与宿主炎症反应,主要影响肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒和组胺的释放。目前关于疥螨翻译控制肿瘤蛋白(SsTCTP)的功能未见相关研究报道,本研究分析了 SsTCTP在疥螨虫体不同发育阶段mRNA相对转录水平,探讨了原核表达的重组蛋白(rSsTCTP)对宿主皮肤血管通透性和ku812细胞脱颗粒的影响,研究结果可能为疥螨的感染机制及疥螨病的防治提供新思路。主要研究工作及结果如下:一、疥螨翻译控制肿瘤蛋白mRNA相对转录水平及重组蛋白对小鼠皮肤血管通透性的影响为了分析SsTCTP mRNA在虫体不同阶段的相对转录水平,并且获得重组蛋白进一步探究其对宿主皮肤血管通透性的影响,以疥螨cDNA为模板克隆获得SsTCTP基因编码序列,利用qRT-PCR方法对SsTCTP mRNA在幼螨、若螨和成螨阶段的相对转录水平进行分析,采用原核表达方法获得重组蛋白rSsTCTP。最后通过构建小鼠伊文思蓝血管渗透模型,探究重组蛋白对小鼠皮肤血管通透性的影响。结果显示,SsTCTP基因编码序列长度是522bp,mRNA在幼螨中的相对转录水平最高,若螨次之,在成螨中的相对转录水平最低。伊文思蓝试验结果显示,rSsTCTP刺激后的皮肤样品在表皮原位和在去离子甲酰胺染料提取并量化测定后,血管通透性都明显升高。总之,SsTCTP在疥螨各个发育阶段均有表达,但在幼螨阶段的表达量相对更高;rSsTCTP皮下刺激后,能升高小鼠皮肤血管通透性,增加血浆渗漏。二、重组疥螨翻译控制肿瘤蛋白(rSsTCTP)对ku812细胞脱颗粒的影响为了进一步探究SsTCTP对宿主肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒通路以及脱粒物质的影响,构建人源嗜碱性粒细胞白血病细胞系(ku812)脱颗粒模型,模拟肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒机制。首先通过β-氨基己糖苷酶(β-HEX)释放试验验证脱颗粒模型构建效果;其次通过WB方法检测脱颗粒通路上主要蛋白表达及磷酸化程度;最后通过ELISA方法分析重组蛋白刺激后组胺和Th2型细胞因子的释放特性。结果显示,rSsTCTP刺激后,β-HEX释放率增加,脱颗粒通路上Lyn、NF-κB及MAPK家族蛋白的磷酸化水平升高,说明rSsTCTP可以激活Lyn介导的脱颗粒通路,诱导ku812细胞脱颗粒反应增强。ELISA结果显示,在重组蛋白刺激后,组胺释放量明显增多,Th2型细胞因子中IL-4、IL-6和IL-13释放量有不同程度的增多。综上,rSsTCTP能激活ku812细胞中Lyn介导的脱颗粒通路,引起组胺及Th2型细胞因子IL-4、IL-6和IL-13释放量不同程度增多。

关键词：疥螨翻译控制肿瘤蛋白 ku812细胞脱颗粒组胺

黄曲霉毒素B_(1)对卵白蛋白激发人外周血嗜碱性白血病细胞(ku812)脱颗粒的影响

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食品安全质量检测学报 2023年第7期14卷 250-256页

作者：邓玉珏武涌陈红兵佟平高金燕南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌330047 南昌大学食品学院南昌330047 江西省食物过敏重点实验室南昌330047 南昌大学中德联合研究院南昌330047

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1), AFB_(1))暴露对鸡蛋过敏原卵白蛋白(ovalbumin, OVA)激发人外周血嗜碱性白血病细胞(ku812)脱颗粒的影响,以阐明AFB_(1)暴露与食物过敏的相关性。方法构建AFB_(1)暴露下OVA激发ku812细胞脱... 详细信息

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1), AFB_(1))暴露对鸡蛋过敏原卵白蛋白(ovalbumin, OVA)激发人外周血嗜碱性白血病细胞(ku812)脱颗粒的影响,以阐明AFB_(1)暴露与食物过敏的相关性。方法构建AFB_(1)暴露下OVA激发ku812细胞脱颗粒模型,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测AFB_(1)对其生物活性介质β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-HEX)和组胺,以及细胞因子白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)释放量的影响;然后采用实时定量荧光聚合酶链反应法分析对IL-4和IL-6的mRNA表达水平的影响。结果 OVA刺激ku812细胞后会使其释放更多生物活性介质,包括β-HEX、组胺及细胞因子(IL-4、IL-6、IL-1β);当有AFB_(1)同时暴露,则会不同程度地加重这些生物活性介质的释放量。其中,AFB_(1)对β-HEX和组胺的释放量影响较小;但能够显著提高细胞因子IL-4、IL-6以及IL-1β的分泌量(Pku812会导致其脱颗粒并释放与食物过敏相关的一些活性介质和细胞因子。而AFB_(1)质量浓度为10000ng/mL的同时暴露,会提高这些相关活性介质和细胞因子的释放量,从而加重OVA所引发的食物过敏反应。

关键词：黄曲霉毒素B1 ku812细胞卵白蛋白白细胞介素-4 白细胞介素-6 白细胞介素-1β

高盐刺激嗜碱性粒细胞产生促炎因子及其分子机制

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食品科学 2023年第3期44卷 120-126页

作者：钟菁华王中亮武涌高金燕陈红兵南昌大学食品科学与技术国家重点实验室江西南昌330047 南昌大学食品学院江西南昌330047 江西省食物过敏重点实验室江西南昌330047 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047

本研究以食物过敏重要的效应细胞嗜碱性粒细胞(ku812)为对象,探究高盐条件对嗜碱性粒细胞脱颗粒以及相关细胞因子表达的影响,并初步探讨其分子机制。首先利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和实时荧光定量... 详细信息

本研究以食物过敏重要的效应细胞嗜碱性粒细胞(ku812)为对象,探究高盐条件对嗜碱性粒细胞脱颗粒以及相关细胞因子表达的影响,并初步探讨其分子机制。首先利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)分析高盐条件下ku812细胞脱颗粒释放生物活性介质和促炎细胞因子的变化;并用q PCR分析血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)抑制剂和P38抑制剂对高盐条件下ku812细胞产生白细胞介素(interleukin,IL)-4的影响。结果表明,高盐条件并不能促进ku812细胞脱颗粒释放生物活性介质组胺和β-氨基己糖苷酶,但能促进其产生促炎因子IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α;高盐条件也可以促进ku812细胞产生IL-4,同时伴随着SGK1基因的高表达,并且使用SGK1抑制剂和P38抑制剂都可以显著抑制高盐条件下ku812细胞表达SGK1和IL-4。综上,高盐条件会通过P38-SGK1信号通路促进ku812细胞产生IL-4。

关键词： ku812细胞白细胞介素4 血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1抑制剂 P38抑制剂

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糖基化联合磷酸化降低鲢鱼小清蛋白致敏性的机制

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食品科学 2023年第4期44卷 17-23页

作者：陈文美周厚泽邵艳红刘俊涂宗财江西师范大学生命科学学院国家淡水鱼加工技术研发专业中心江西南昌330022 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室江西南昌330047

以鲢鱼小清蛋白(parvalbumin,PV)为研究对象,采用糖基化联合磷酸化对其进行修饰,运用光谱、质谱和ku812细胞实验等方法研究修饰后鲢鱼PV抗原表位和致敏性的变化。结果表明:糖基化联合磷酸化修饰可增加鲢鱼PV分子质量,降低游离氨基含量,... 详细信息

以鲢鱼小清蛋白(parvalbumin,PV)为研究对象,采用糖基化联合磷酸化对其进行修饰,运用光谱、质谱和ku812细胞实验等方法研究修饰后鲢鱼PV抗原表位和致敏性的变化。结果表明:糖基化联合磷酸化修饰可增加鲢鱼PV分子质量,降低游离氨基含量,且改变其二级结构和构象结构;糖基化联合磷酸化修饰后的鲢鱼PV含有8个糖基化位点(K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108)和1个磷酸化位点(S56)。糖基化联合磷酸化修饰能显著降低鲢鱼PV与IgG/IgE的结合能力,也能降低ku812细胞中组胺和白介素-6的释放能力。因此,糖基化联合磷酸化修饰通过糖基化和磷酸化位点遮掩鲢鱼PV的线性表位和破坏其构象表位,降低其致敏性。研究结果为开发低致敏性鱼类制品提供重要的理论依据。

关键词：鲢鱼小清蛋白糖基化联合磷酸化修饰位点致敏性 ku812细胞

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类过敏反应体外评价模型的建立及其指标的筛选

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中国新药杂志 2017年第14期26卷 1649-1660页

作者：李伟陈梦黄芝瑛姜华李波中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室北京100176 中山大学药学院广州510006

目的:以C48/80为阳性药物,比较3种细胞系(RBL-2H3,P8l5和ku812细胞)及其指标在评价药物类过敏中的敏感性;并采用聚山梨酯80对3种细胞模型评价类过敏反应的适用性进行考察。方法:以不同浓度的C48/80分别作用于3种细胞系30和60 min,测定β... 详细信息

目的:以C48/80为阳性药物,比较3种细胞系(RBL-2H3,P8l5和ku812细胞)及其指标在评价药物类过敏中的敏感性;并采用聚山梨酯80对3种细胞模型评价类过敏反应的适用性进行考察。方法:以不同浓度的C48/80分别作用于3种细胞系30和60 min,测定β-氨基糖苷酶释放率、Annexin V阳性细胞率以及IL-4和TNF-α释放量。然后,用聚山梨酯80进行模型的适用性考察,同时对不同浓度的聚山梨酯80引起的类过敏反应进行评价。结果:C48/80可引起3种细胞系的β-氨基糖苷酶释放率、Annexin V阳性细胞率、IL-4释放量和TNF-α释放量呈剂量依赖性增加;除了RBL-2H3细胞,其他2个细胞系检测到的IL-4释放量非常少,且3种细胞系检测到的TNF-a量亦非常少;Annexin V阳性细胞率的增加程度较其他3项指标明显;在相同刺激条件下,P815和ku812细胞的β-氨基糖苷酶释放率和Annexin V阳性细胞率的突增较RBL-2H3细胞发生时间早,突增效果更明显。聚山梨酯80的结果与C48/80给药时基本吻合。此外,还发现聚山梨酯80≥0.05 mg·m L^(-1)时,即存在引起类过敏反应的风险。结论:β-氨基己糖苷酶释放率和Annexin V阳性细胞率是评价类过敏反应的2种稳定、可靠、重复性好的检测指标;IL-4释放量和TNF-α释放量较适合作为辅助检测指标;Annexin V阳性率可较敏感地、较早地提示类过敏反应的发生。P815和ku812细胞较RBL-2H3细胞更适合作为一种早期、稳定、敏感的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,用于致类过敏反应药物的早期筛选。

关键词：类过敏反应 RBL-2H3细胞 P8l5细胞 ku812细胞体外

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高盐诱导食物过敏易感性的细胞学初步研究

高盐诱导食物过敏易感性的细胞学初步研究

作者：钟菁华南昌大学

学位级别：硕士

饮食结构的改变被认为是食物过敏的发病率逐年增长的潜在驱动因素。现已证明,西方的高脂肪和低膳食纤维饮食可以影响食物过敏的易感性。而高盐饮食对食物过敏的影响尚不清楚。研究表明,高盐饮食可以影响机体的免疫系统,特别是可以调节T... 详细信息

饮食结构的改变被认为是食物过敏的发病率逐年增长的潜在驱动因素。现已证明,西方的高脂肪和低膳食纤维饮食可以影响食物过敏的易感性。而高盐饮食对食物过敏的影响尚不清楚。研究表明,高盐饮食可以影响机体的免疫系统,特别是可以调节Th17和Treg细胞的功能。因此,本论文以食物过敏反应中ku812细胞(嗜碱性粒细胞)和Caco-2细胞(一种重要的肠上皮细胞)为对象,研究高盐暴露对卵白蛋白(OVA)引发食物过敏ku812细胞脱颗粒的影响,并通过转录组学的分析手段,初步研究高盐对ku812细胞释放IL-4(促炎因子)的作用机制;最后,利用体外肠道上皮细胞Caco-2模型和小鼠动物试验,研究高盐对肠道屏障功能的影响。研究的方法、结果及结论如下:1.采用OVA致敏的ku812细胞脱颗粒模型,研究高盐对细胞脱颗粒的影响。与阳性对照组相比,高盐组的组胺和β-氨基己糖苷酶的释放量无显著性差异(P>0.05);两组间的IL-6和TNF-ɑ释放量具有显著性差异(Pku812细胞分泌促炎细胞因子IL-6、TNF-ɑ以及IL-4,不能促进其分泌组胺和β-氨基己糖苷酶。高盐能够加重食物过敏阶段ku812细胞的炎症因子反应。2.分别采用SGK1和P38抑制剂对ku812细胞产生IL-4进行干预实验,研究高盐促进ku812细胞产生IL-4的分子机制。结果表明:高盐可以促进ku812细胞产生IL-4,并使NFAT5和SGK1基因的表达被提高。同时也发现:在高盐条件下,SGK1抑制剂可以显著性抑制ku812细胞表达SGK1和IL-4基因;而P38抑制剂可以显著性抑制ku812细胞表达NFAT5、SGK1和IL-4基因。因此,高盐会通过P38-NFAT5-SGK1信号通路来促进ku812细胞产生IL-4,IL-4同时也是Th2型细胞免疫的关键细胞因子,高盐也可以促进食物过敏的产生。3.运用转录组测序技术(RNA-seq)分析高盐对ku812细胞释放促炎因子IL-4的机制。通过DNBSEQ平台对差异基因分析,共筛选出437个差异基因,其中有293个转录水平表达被上调,144个转录水平表达被下调。通过KEGG和GSEA的结果,高盐对ku812细胞影响的机制包括有PI3K-Akt、MAPK、Rap1、m TOR、Fox O和Wnt信号通路的参与,其中Wnt、MAPK和Rap1信号通路被显著性激活,并可能起主导作用,P38、NFAT5和SGK1基因也会参与其中。***-2细胞经高盐处理后,分别采用Q-PCR和Western-Blot二种方法检测其中ZO-1、Occludin以及Claudin-1蛋白表达量,高盐可以不同程度降低这三种蛋白的表达量。其中,Q-PCR的检测结果为ZO-1(P0.05)。Western-Blot实验结果为ZO-1蛋白的表达量显著降低(P0.05)。高盐会破坏Caco-2细胞紧密连接蛋白的功能,导致其通透性增加。5.试验小鼠经高盐饮食(4.0%NaCl的饲料+1.0%NaCl的饮用水)饲喂3周,其肠细胞中的ZO-1、Occludin以及Claudin-1三种蛋白的表达量均出现不同程度的降低。FITC-dextran的实验结果也表明,高盐饮食组小鼠血清中FITC-dextran浓度显著性升高(P<0.01)。高盐饮食会破坏小鼠肠道屏障,提高小鼠肠道的通透性。

关键词： NaCl 卵白蛋白 ku812细胞 Caco-2细胞转录组学肠道屏障

四种黄酮类物质对ω-5麦醇溶蛋白肽致敏性及其诱导的Caco-2细胞屏障损伤的调节作用

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四种黄酮类物质对ω-5麦醇溶蛋白肽致敏性及其诱导的Caco-2细胞屏...

作者：吴双双南昌大学

学位级别：硕士

目的:儿童小麦食物过敏是由Ig E介导的I型过敏反应,因其反应迅速、强烈,又称为速发型超敏反应,对皮肤、呼吸道及胃肠道等部位均有影响。小麦中的ω-5麦醇溶蛋白是主要过敏原之一。目前,推荐的有效治疗方法是饮食回避。然而小麦被广泛用... 详细信息

目的:儿童小麦食物过敏是由Ig E介导的I型过敏反应,因其反应迅速、强烈,又称为速发型超敏反应,对皮肤、呼吸道及胃肠道等部位均有影响。小麦中的ω-5麦醇溶蛋白是主要过敏原之一。目前,推荐的有效治疗方法是饮食回避。然而小麦被广泛用于食品加工,故难以完全避免小麦蛋白的摄入。因此,有必要研究其他的辅助治疗方法,以减轻过敏反应。黄酮类化合物属于多酚类植物次生代谢产物,广泛存在于蔬菜、水果和植物中,具有抗氧化、抗炎和免疫调节特性,有可能缓解ω-5麦醇溶蛋白诱发的食物过敏反应及肠道炎症反应。本研究探究四种黄酮类物质对ω-5麦醇溶蛋白肽致敏性及其诱导的Caco-2细胞屏障损伤的影响,为探寻黄酮类物质用于辅助治疗小麦过敏奠定基础。方法:建立体外模拟婴幼儿胃肠道消化模型,消化麦醇溶蛋白,结合儿童小麦过敏的主要过敏原ω-5麦醇溶蛋白过敏表位信息,筛选并合成出耐消化的ω-5麦醇溶蛋白致敏肽。随后通过构建ku812细胞脱颗粒模型,检测各ω-5麦醇溶蛋白致敏肽作用于ku812细胞4 h后所释放的β-Hex、组胺、IL-6及TNF-α的含量,筛选出致敏性较强的ω-5麦醇溶蛋白肽;再采用致敏性较强的ω-5麦醇溶蛋白肽（150μg/m L）诱导建立ku812细胞脱颗粒模型,检测黄酮类物质黄芩素、木犀草素、异鼠李素及柚皮素预处理0.5 h后,ku812细胞β-Hex、组胺、IL-6及TNF-α的释放量的变化,探究四种黄酮类物质对ω-5麦醇溶蛋白肽致敏性的影响;建立Caco-2肠上皮细胞单层模型,预先给予四种黄酮类物质孵育3 h,而后加入150μg/m L致敏性较强的ω-5麦醇溶蛋白肽作用24 h,建立ω-5麦醇溶蛋白肽诱导的Caco-2肠上皮细胞细胞单层屏障损伤模型,采用ELISA法检测检测炎症因子IL-6、IL-8及人连蛋白Zonulin的含量,并采用免疫印迹法检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达,探究四种黄酮类物质对ω-5麦醇溶蛋白肽诱导的Caco-2细胞炎症反应及其屏障损伤的调节作用。结果:筛选出耐消化的ω-5麦醇溶蛋白致敏肽,并合成了四条肽段,分别为P1:AA374-404,P2:AA160-189,P3:AA252-271,P4:AA253-279。其中ω-5麦醇溶蛋白肽P4诱导ku812细胞脱颗粒能力最强,与未加肽段处理的空白组相比,肽P4会抑制ku812细胞活力,促进ku812细胞β-Hex、组胺、IL-6及TNF-α的释放（P＜0.05）,成功构建ω-5麦醇溶蛋白肽诱导的ku812细胞脱颗粒模型。四种黄酮类物质黄芩素、木犀草素、异鼠李素及柚皮素可显著抑制肽P4诱导的ku812细胞活力降低;抑制肽P4诱导的ku812细胞释放β-Hex、组胺、IL-6及TNF-α,其中异鼠李素的抑制作用随着作用浓度的升高而增强（P＜0.05）。ω-5麦醇溶蛋白肽P4会促进Caco-2细胞单层分泌炎症因子IL-6、IL-8,促进人连蛋白Zonulin的释放并降低紧密连接蛋白Occludin及ZO-1的表达（P＜0.05）,成功构建ω-5麦醇溶蛋白肽诱导的Caco-2细胞炎症及其屏障损伤模型。四种黄酮类物质黄芩素、木犀草素、异鼠李素及柚皮素可显著抑制肽P4诱导的Caco-2细胞活力下降;剂量依赖性抑制肽P4诱导Caco-2细胞IL-6、IL-8的释放（P＜0.05）;抑制人连蛋白Zonulin的释放并能显著增加Caco-2细胞单层紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的表达（P＜0.05）。结论:四种黄酮类物质黄芩素、木犀草素、异鼠李素及柚皮素可抑制ω-5麦醇溶蛋白肽刺激的ku812细胞脱颗粒,具有一定的抗过敏作用;减轻ω-5麦醇溶蛋白肽造成的Caco-2细胞炎症并保护其屏障功能。

关键词：黄酮类物质小麦食物过敏 ω-5麦醇溶蛋白 Caco-2细胞 ku812细胞

过敏原上调嗜碱性粒细胞中Toll样受体9表达的研究

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过敏原上调嗜碱性粒细胞中Toll样受体9表达的研究

作者：钟晴沈阳医学院

学位级别：硕士

目的有研究报道Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)的表达可能与包括过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)在内的Th2(T helper type 2,Th2)型过敏性炎症有关。但关于TLR9在AR患者嗜碱性粒细胞中的表达情况却知之甚少。因此本研究检测... 详细信息

目的有研究报道Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)的表达可能与包括过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)在内的Th2(T helper type 2,Th2)型过敏性炎症有关。但关于TLR9在AR患者嗜碱性粒细胞中的表达情况却知之甚少。因此本研究检测过敏原激发前后AR患者外周血嗜碱性粒细胞、ku812细胞和致敏小鼠外周血嗜碱性粒细胞中的TLR9表达,以期为嗜碱性粒细胞TLR9在AR发病机制中的作用研究提供实验数据。方法1.人外周血嗜碱性粒细胞激发试验:募集23名健康志愿者和46名AR患者外周血标本,流式细胞术检测屋尘螨过敏原提取物(Dermatophagoide allergen extract,DAE)、大籽蒿过敏原提取物(Artemisia sieversiana wild allergen extract,ASWAE)和梧桐花粉过敏原提取物(Platanus pollen allergen extract,PPAE)激发前后人外周血嗜碱性粒细胞中TLR9的表达。***812细胞培养及激发实验:用ATCC标准RPMI 1640培养基培养ku812细胞。用不同浓度的屋尘螨重组蛋白(Dermatophagoides Pteronyssinus 1,Der p1)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)、TLR9配体(CpG)、白介素-31(Interleukin-31,IL-31)、IL-33、IL-37、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、健康人血浆、DAE、ASWAE和AR患者血浆刺激ku812细胞30 min、2 h和16 h,收集细胞和上清。一部分细胞用于流式细胞术检测TLR9表达变化,一部分细胞重悬于Trizol中进行qPCR检测TLR9 mRNA表达变化;上清用于ELISA检测IL-4,IL-6和IL-13等细胞因子水平。3.小鼠致敏及激发实验:随机挑选14只小鼠,致敏组和非致敏组各7只,致敏组分别于第0、7、14、21天皮下多点注射OVA加氢氧化铝佐剂,非致敏组在同一天注射相同体积的生理盐水(Normal saline NS),第28天,对小鼠进行滴鼻激发,致敏组双侧鼻腔滴入1%OVA各10μl,非致敏组滴入相同体积的NS,连续滴鼻7天,最后一天滴鼻后,等待3 h后处死动物,收集血液用于流式细胞检测嗜碱性粒细胞中TLR9的表达情况。结果1.流式细胞术检测AR患者外周血嗜碱性粒细胞中TLR9+百分比和平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)表达结果:AR患者粒细胞群中TLR9+CCR3+细胞的百分比表达较健康对照组(Healthy control,HC)增高46%,而在单个核细胞群(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中TLR9+CCR3+(Chemokine CCR receptor3,CCR3)细胞的百分比无显著差异。DAE和PPAE激发后,AR患者粒细胞群中TLR9+CCR3+细胞的百分比表达较静息状态分别增高76%和84%。DAE和PPAE激发后,在粒细胞群和PBMC群中,AR患者TLR9+CD123+HLA-DR-(Human Leukocyte Antigen-DR,HLA-DR)和TLR9+CCR3+CD123+HLA-DR-细胞的比例均明显增高。***812细胞激发实验结果显示:CpG可诱导ku812细胞TLR9表达增强,IL-37、IL-31、IL-33、ASWAE和DAE可诱导ku812细胞中TLR9 mRNA表达增强并且释放IL-6水平升高;OVA和Der p1诱导ku812细胞释放IL-13水平升高。***致敏的小鼠血液中嗜碱性粒细胞中TLR9+百分比表达升高,与对照组相比,OVA致敏小鼠血液嗜碱性粒细胞中TLR9的百分比表达明显增高。结论本研究首次发现AR患者外周血嗜碱性粒细胞中TLR9的表达增强;多种过敏原及炎症因子可以诱导ku812细胞释放IL-6和IL-13水平上调;过敏原可以诱导AR患者和致敏小鼠血液嗜碱性粒细胞中TLR9的表达上调。本研究结果提示嗜碱性粒细胞可能通过TLR9参与AR的病理生理过程。

关键词：过敏性鼻炎 Toll样受体9 嗜碱性粒细胞过敏原细胞因子 ku812细胞

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黄曲霉毒素B1暴露对卵白蛋白致敏性的影响

黄曲霉毒素B1暴露对卵白蛋白致敏性的影响

作者：邓玉珏南昌大学

学位级别：硕士

随着社会发展和生产力水平的提高,但是食品的生物性安全问题仍时有发生,每年造成巨大的经济损失并存在极大健康隐患。人们通过摄食受污染的植物性食物(谷物)或动物性食物(肉、奶和蛋)摄入真菌毒素,而对人体健康带来危害。食物过敏是一... 详细信息

随着社会发展和生产力水平的提高,但是食品的生物性安全问题仍时有发生,每年造成巨大的经济损失并存在极大健康隐患。人们通过摄食受污染的植物性食物(谷物)或动物性食物(肉、奶和蛋)摄入真菌毒素,而对人体健康带来危害。食物过敏是一些特殊人群暴露于某些含有过敏原的食物后所免疫系统的异常反应,其发生率也在逐年上升,严重影响患者的健康与生活质量。鸡蛋、牛奶及花生等食物含有主要的食物过敏原,同时也容易被真菌毒素污染,2种食品安全风险因子都具有免疫毒性,也在这些食物上具有重合性。因此,食品真菌毒素污染对食物过敏发生的影响值得进一步研究,有助于进一步科学评估食物过敏的风险因素。本论文分别从整体动物模型和体外细胞实验研究黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)暴露对卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠主要免疫指标的影响。根据致敏小鼠血清中特异性抗体、肥大细胞蛋白酶、脾细胞分泌细胞因子及空肠中食物过敏相关基因表达等多个理化指标,评估AFB暴露对OVA致敏小鼠产生的影响;并通过对小鼠肠道切片影响的观察及其肠道内容物菌群的分析,评估AFB暴露对OVA致敏小鼠的肠道黏膜免疫及肠道菌群的影响。通过构建OVA激发ku812细胞脱颗粒模型,评估AFB暴露对OVA激发ku812细胞脱颗粒的影响,进一步从细胞水平阐述AFB暴露对食物过敏的影响。论文研究主要方法、内容和结果如下:(1)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测OVA致敏小鼠血清中特异性抗体Ig E、Ig G、Ig G1及Ig G2a的含量及其肥大细胞蛋白酶的水平;采用ELISA商用试剂盒检测OVA致敏小鼠脾脏上清液中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平;采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测相关基因表达;流式细胞术检测Th1/Th2/Treg细胞的数量。结果表明,OVA致敏小鼠血清中特异性Ig E、m MCP-1水平及Th2细胞产生的细胞因子(IL-4、IL-5及IL-13)水平显著升高,OVA致敏模型构建成功。低剂量AFB使OVA致敏小鼠的特异性Ig E水平、IL-4及IL-13水平显著提升,分别提升68%、41%及75%;中剂量AFB使OVA致敏小鼠的m MCP-1和IL-13的水平显著提升;中剂量AFB使OVA致敏小鼠的m MCP-1和IL-5的水平显著提升,分别提高107%和22%;持续高剂量AFB对各项过敏指标没有显著改变。在4组AFB暴露的致敏小鼠体内,与Th1相关细胞因子(IFN-γ)的水平均有所下降,但无统计学意义。这些结果也Q-PCR和流式细胞分析得到进一步验证。(2)通过HE染色法对OVA致敏及其AFB暴露的BALB/c小鼠空肠组织空肠进行病理分析,并利用Illumina Mi Seq高通量测序平台对不同实验组小鼠盲肠内容物中的细菌16S r RNA V3—V4区的扩增子进行PCR扩增,然后采用生物信息学手段分析AFB暴露对OVA致敏小鼠的肠道菌群的结构、多样性及差异物种的影响。结果表明,OVA会导致小鼠肠道绒毛断裂以及肠腺体间距明显增宽;高剂量和持续高剂量AFB暴露对OVA致敏小鼠肠道屏障造成的损伤更严重。OTUs聚类分析(物种累积曲线、RANK分析、花瓣图)结果显示,各组小鼠的OTUs数目范围为514～521,OTUs数目共有率为94.6%,AFB对小鼠肠道菌群OTUs数目和均匀度影响较小。Alpha多样性分析表明,AFB暴露并未对小鼠肠道菌群的多样性和丰富度产生较大影响。Beta多样性分析表明,AFB使OVA致敏小鼠肠道菌群的结构发生重大变化,OVA组与中/高剂量AFB暴露组小鼠肠道菌群间Beta多样性距离有显著性差异。在门水平上,OVA致敏小鼠肠道厚壁菌门相对丰度显著下降,拟杆菌门和变形菌门相对丰度显著上升。AFB使OVA致敏小鼠肠道厚壁菌门相对丰度下降,拟杆菌门和变形菌门相对丰度上升,并以高剂量AFB影响最为显著。(3)采用ELISA法检测AFB对其释放生物活性介质β-氨基己糖苷酶(β-HEX)与组胺,以及细胞因子(IL-4、IL-6及IL-1β)释放量的影响;然后,采用Q-PCR分析对IL-4和IL-6的m RNA表达水平的影响。结果表明,AFB对OVA刺激ku812细胞脱颗粒释放β-HEX和组胺的影响较小,但能够促进其分泌细胞因子IL-4、IL-6以及IL-1β,释放量分别提高59%、30%及84%。同时,IL-4和IL-6的m RNA基因的表达水平也被提高,分别提高60%和23%。综上所述,从整体动物模型、肠道菌群分析结果及体外细胞实验结果都证明AFB暴露会加重OVA致敏性。

关键词：食物过敏黄曲霉毒素B1 Balb/c小鼠肠道菌群 ku812细胞