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klf10沉默抑制机械力诱导的人牙周膜细胞成骨向分化

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上海口腔医学 2017年第6期26卷 599-604页

作者：余小琴李云龙高锦瑜刘华安康市人民医院口腔科陕西安康725000 延安大学附属医院口腔医院正畸科陕西延安716000

目的 :探讨klf10沉默对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)受力后骨向分化的影响。方法:分离培养HPDLCs,RNA干扰沉默klf10的表达,用离心加力法对细胞加载机械力,并予hedgehog信号通路特异性激动剂purmorphamine进... 详细信息

目的 :探讨klf10沉默对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)受力后骨向分化的影响。方法:分离培养HPDLCs,RNA干扰沉默klf10的表达,用离心加力法对细胞加载机械力,并予hedgehog信号通路特异性激动剂purmorphamine进行干预。采用ELISA法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,采用RT-PCR和Western印迹法分别检测各组细胞klf10 m RNA和蛋白表达水平,并检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)m RNA和蛋白的表达情况;利用Western免疫印迹法检测hedgehog信号转导通路成员胶质瘤相关癌基因同源物1(glioma-associated oncogene homolog 1,GLI1)和Ptch1(patched-1)的蛋白表达。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 :机械力诱导6 h后,klf10、Runx2、OPN和OCN m RNA和蛋白的表达显著升高,ALP活性升高,GLI1和Ptch1蛋白表达升高(Pklf10 si RNA组klf10 m RNA和蛋白水平显著降低(Pklf10 si RNA显著抑制ALP活性,下调Runx2、OPN和OCN m RNA和蛋白的表达,抑制GLI1和Ptch1蛋白表达(Pklf10 si RNA沉默介导的成骨分化效应(Pklf10沉默可以抑制机械力作用下HPDLCs的骨向分化,可能与调节hedgehog信号转导通路有关。

关键词：口腔正畸 klf10 人牙周膜细胞机械力成骨分化

Deciphering the Role of klf10 in the Cerebellum

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Journal of Biomedical Science and Engineering 2022年第5期15卷 140-156页

作者： Malek Kammoun Lydie Nadal-Desbarats Sandra Même Aude Lafoux Corinne Huchet Géraldine Meyer-Dilhet Julien Courchet Frédéric Montigny Frédéric Szeremeta William Même Vladimir Veksler Jérôme Piquereau Philippe Pouletaut Malayannan Subramaniam John R. Hawse Jean-Marc Constans Sabine F. Bensamoun Biomechanics and Bioengineering CNRS UMR 7338 Sorbonne University—University of Technology of Compiègne Compiègne France iBrain CNRS UMR 1253 University of Tours Tours France Center for Molecular Biophysics CNRS UPR4301 Orléans France Therassay Platform University of Nantes Nantes France INSERM UMR1089 University of Nantes Nantes France CNRS UMR-5310 and INSERM U-1217 NeuroMyoGène Institute Villeurbanne France INSERM PST-ASB University of Tours Tours France INSERM UMR-S 1180 University of Paris-Saclay Chatenay-Malabry France Department of Biochemistry and Molecular Biology Mayo Clinic Rochester USA CHIMERE EA7516 UPJV Faire Faces Institute Amiens France

Recent studies have demonstrated a new role for klf10, a Krüppel-like transcription factor, in skeletal muscle, specifically relating to mitochondrial function. Thus, it was of interest to analyze additional tissues that are highly reliant on optimal mitochondrial function such as the cerebellum and to decipher the role of klf10 in the functional and structural properties of this brain region. In vivo (magnetic resonance imaging and localized spectroscopy, behavior analysis) and in vitro (histology, spectroscopy analysis, enzymatic activity) techniques were applied to comprehensively assess the cerebellum of wild type (WT) and klf10 knockout (KO) mice. Histology analysis and assessment of locomotion revealed no significant difference in klf10 KO mice. Diffusion and texture results obtained using MRI revealed structural changes in KO mice characterized as defects in the organization of axons. These modifications may be explained by differences in the levels of specific metabolites (myo-inositol, lactate) within the KO cerebellum. Loss of klf10 expression also led to changes in mitochondrial activity as reflected by a significant increase in the activity of citrate synthase, complexes I and IV. In summary, this study has provided evidence that klf10 plays an important role in energy production and mitochondrial function in the cerebellum.

关键词： klf10 Cerebellum Mice Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy Metabolomics Mitochondria

klf10在流体剪切力促BMSCs成骨分化中的作用及机制

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KLF10在流体剪切力促BMSCs成骨分化中的作用及机制

作者：姚景柯新乡医学院

学位级别：硕士

背景骨缺损的修复一直是困扰临床骨科医生的关键问题,目前临床上常用的方法是自体髂骨移植,但受到取材部位和取材量等因素的限制,运用组织工程技术在体外成骨后再移植回体内的异体骨移植则是未来临床骨缺损治疗的另一重要方向。骨髓间... 详细信息

背景骨缺损的修复一直是困扰临床骨科医生的关键问题,目前临床上常用的方法是自体髂骨移植,但受到取材部位和取材量等因素的限制,运用组织工程技术在体外成骨后再移植回体内的异体骨移植则是未来临床骨缺损治疗的另一重要方向。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是具有分化潜力,被认为是一种有吸引力的骨修复和再生细胞来源。机械力可刺激骨的形成,在调节和维持骨组织稳态方面起着关键作用。因此,明确在力的作用下BMSCs的分化机制对于治疗骨缺损具有很大临床意义。目的明确力学刺激如何调控BMSCs成骨分化,明确力学调控BMSCs成骨分化具体的分子机制。方法1.显微镜观察对BMSCs进行成骨诱导以及流体剪切力刺激后其形态变化情况。2.利用茜素红(Alizarin Red S,简称ARS)染色观察不同处理组的BMSCs在成骨分化过程中钙沉积水平。3.利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,简称ALP)染色观察不同处理组的BMSCs在成骨分化过程中ALP含量的变化。***检测试剂盒检测不同处理组的BMSCs在成骨分化过程中ALP活力的变化。5.钙含量检测试剂盒检测不同处理组的BMSCs在成骨分化过程中钙含量的变化。6.运用生物信息学分析对不同处理组细胞进行差异基因分析及筛选。7.利用慢病毒感染干扰目标基因克隆性转录因子10(Krüppel-like Factor 10,简称klf10);利用q-PCR和Western blotting检测各组细胞中klf10的表达水平。8.利用q-PCR检测不同处理组的BMSCs在成骨分化过程中成骨标志基因ALP、骨桥蛋白(Osteopontin,简称OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related Transcription Factor2,简称RUNX2)表达水平。9.利用q-PCR等方法检测低表达klf10后前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2,简称PTGS2)的表达水平。结果1.光学显微镜观察结果显示,经成骨诱导后,BMSCs形态细胞呈多角形或梭形,排列更加紧密,FSS刺激后细胞逐渐变为细长且定向排列。***染色结果显示,与成骨诱导组(使用成骨诱导基培养7天,成骨诱导培养基Osteogenic Induction Medium,简称OIM组)相比,流体剪切力刺激组(使用成骨诱导培养基培养7天+连续3天流体剪切力刺激,流体剪切Fluid Shear Stress,简称OIM+FSS组)细胞ARS染色显著增强。***染色结果表示,与OIM组相比,OIM+FSS组细胞ALP含量显著增加。***活力检测结果显示,与OIM组相比,OIM+FSS组细胞ALP活力显著增强。5.钙含量检测结果显示,与OIM组相比,OIM+FSS组细胞钙含量显著增多。6.q-PCR结果显示,与未处理组相比,OIM诱导0天、7天、14天后,成骨相关基因ALP、OPN、RUNX2表达明显上升。与OIM组相比,OIM+FSS组成骨相关的基因表达进一步升高。7.采用RStudio软件进行了GO分析和KEGG富集分析,运用string网站将测序筛选出的差异基因进行蛋白互作预测和分析,筛选出靶基因klf10。8.慢病毒感染干扰靶基因klf10后的结果显示,BMSCs成骨分化水平明显降低,且干扰klf10后PTGS2及BMP9的表达同时降低。结论FSS刺激可增强OIM诱导的BMSCs成骨分化,在剪切力刺激下klf10可通过PTGS2影响成骨标志基因的表达,从而影响成骨分化。

关键词： klf10 PTGS2 剪切力成骨分化

klf10通过HIF-1α/klf10/Parkin轴介导氧化应激下的线粒体自噬减轻肝脏缺血再灌注损伤

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KLF10通过HIF-1α/KLF10/Parkin轴介导氧化应激下的线粒体自噬减...

作者：金岩青岛大学

学位级别：硕士

研究背景:肝脏移植历经了半个多世纪的发展,目前已成为治疗各种终末期肝病唯一的有效方法,并且可以极大地改善早期肝癌患者的预后。随着手术技术的逐渐完善,肝移植围术期死亡率仅为5%,术后1年生存率可达90%。肝脏缺血再灌注损伤(LIRI)... 详细信息

研究背景:肝脏移植历经了半个多世纪的发展,目前已成为治疗各种终末期肝病唯一的有效方法,并且可以极大地改善早期肝癌患者的预后。随着手术技术的逐渐完善,肝移植围术期死亡率仅为5%,术后1年生存率可达90%。肝脏缺血再灌注损伤(LIRI)是肝脏在遭受缺血损伤后重新获得血液灌注,反而加重功能障碍和结构损伤的现象。LIRI是肝移植术及肝脏部分切除术中常见的病理生理现象,是影响患者预后和术后死亡率的重要危险因素。探索LIRI的发生机制,对于减少供肝的保存损伤,提高边缘供肝的利用率,减少肝移植等待时间,改善肝移植术后患者预后有着重要的意义。Krüppel样因子10(klf10)是一种转录调节因子,是TGF-β通路上的重要一环,可以在多种生理过程中发挥重要作用。研究证实,klf10与氧化应激、自噬和缺血再灌注损伤有着千丝万缕的联系,且在多种肝脏疾病中发挥着重要作用,可以改善下肢和心肌缺血再灌注损伤。因此,klf10可能是一个重要的LIRI的治疗靶点,但是尚未有研究证实klf10在LIRI中的作用。自噬是一种细胞内细胞器和蛋白质自我消化的途径,线粒体的自噬参与了氧化应激和细胞死亡过程的调节,其中PINK1/Parkin通路是线粒体自噬的主要途径。目前,已有研究证实线粒体自噬可以通过调控线粒体自噬途径减少活性氧(ROS)的产生,并减少细胞凋亡,减轻LIRI。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞内氧稳态的关键因子,与β亚基共同激活下游基因的转录。在LIRI中,ROS激活的氧化应激发挥了主导作用。研究表明,氧化应激反应中,ROS可以上调HIF-1α的水平,HIF-1α可以通过线粒体途径减少ROS的产生,并通过增加线粒体自噬减轻LIRI。但是其具体的分子生物学机制仍不清楚。研究目的:1.探究LIRI的影响因素。2.明确klf10在LIRI时调控氧化应激介导的线粒体自噬和细胞凋亡的分子机制。3.探讨klf10作为预防或治疗LIRI的靶点进行的临床转化的可能性及意义。研究方法:1.生物信息学分析:使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因表达综合数据库(GEO)中肝缺血再灌注数据集GSE14951和klf10过表达的原代肝细胞数据集GSE197054对差异基因进行筛选,并使用基因本体(GO)、基因集富集分析(GSEA)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)等生物信息学工具对信号通路进行富集分析。2.细胞LIRI模型构建:使用MIHA和LO-2正常肝细胞系通过可变控氧细胞培养箱构建细胞缺血再灌注模型,缺血时间分别选取0小时、6小时、12小时和24小时,再灌注时间选取0小时、2小时、6小时和12小时。之后通过慢病毒转染的方法,改变klf10、Parkin、HIF-1α的表达水平以探究基因的功能和分子机制;通过GFP-mRFP-LC3腺病毒的转染进行自噬通量的检测。3.动物LIRI模型构建:使用SD大鼠构建大鼠肝移植模型,C57BL/6小鼠构建小鼠肝脏缺血再灌注模型。大鼠肝移植模型分别在灌注前、灌注后、关腹前、门脉开放后、关腹前、术后3天、术后7天获取样本;小鼠肝脏缺血再灌注模型,则将缺血时间固定为1小时,再灌注时间分别选取0小时、6小时、12小时和24小时进行实验,并使用AAV8腺相关病毒通过尾静脉注射的方法对小鼠的肝细胞进行klf10基因表达的干扰。4.临床样本的收集及分析:纳入2020年1月到2021年1月在青岛大学附属医院进行器官捐献和肝脏移植的患者。首先统计分析了一般临床资料,之后对器官捐献者的供肝进行采样,分别选择灌注前、灌注后10分钟、门脉开放后30分钟、动脉开放后30分钟、关腹前进行取样,并对对应的肝移植受体术前1天和术后48小时的肝脏功能进行分析。5.样本处理:1)基因表达水平的改变。通过慢病毒和腺相关病毒的转染,对MIHA、LO-2细胞和C57小鼠的klf10、Parkin、HIF-1α的表达量进行改变;通过对MIHA细胞进行Baf A1的处理和mRFP-GFP-LC3腺病毒的转染,探究自噬流的变化;2)基因表达水平的检测。通过蛋白免疫印记法、实时荧光定量PCR的方法,对样本的klf10、LC3、Parkin、PINK1、COXⅣ、P62的表达水平进行检测,评估自噬通量的变化;检测Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2的表达水平,探究细胞凋亡的变化情况;3)细胞凋亡和损伤的检测。使用流式细胞仪通过Annexin V-FITC/PI染色法对缺血再灌注过程中的细胞凋亡率进行检测;通过ELISA对ALT和AST检测验证细胞的损伤程度;4)细胞成像。通过双标腺病毒转染,使用电子显微镜、共聚焦显微镜对细胞的自噬水平进行检测;通过TUNEL染色、HE染色的方法使用荧光显微镜对细胞的损伤、凋亡进行检测;5)染

关键词： klf10 缺血再灌注损伤线粒体自噬 HIF-1α Parkin

klf10对山羊肌内前体脂肪细胞分化的调控作用研究

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KLF10对山羊肌内前体脂肪细胞分化的调控作用研究

作者：池永东西南民族大学

学位级别：硕士

作为Krüppel样转录因子(Krüppel-like factors,klf)家族成员之一,klf10具有三个高度保守的Cys2/His2锌指结构,调控着细胞的很多功能。最近有学者在小鼠3T3-L1细胞系中发现klf10与脂肪细胞分化有关。但在反刍动物尤其是山羊(Capra hirc... 详细信息

作为Krüppel样转录因子(Krüppel-like factors,klf)家族成员之一,klf10具有三个高度保守的Cys2/His2锌指结构,调控着细胞的很多功能。最近有学者在小鼠3T3-L1细胞系中发现klf10与脂肪细胞分化有关。但在反刍动物尤其是山羊(Capra hircus)上尚未见到相关报道,本实验室前期转录组测序结果表明klf10可能参加山羊肌内脂肪细胞分化。因此本研究以简州大耳羊为试验动物,利用细胞培养、实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)、Western Blot、过表达、RNA干扰和双荧光素酶报告实验等方法在克隆获得山羊klf10基因序列的基础上,明确了klf10对山羊肌内前体脂肪细胞分化的调控作用及阐明了其可能的作用机制。主要获得以下研究成果:(1)成功克隆获得山羊klf10基因序列1457 bp,包括完整的CDS区1449bp,编码482个氨基酸;筛选并确定了TBP为山羊组织器官中表达最稳定的内参基因,组织表达结果显示klf10在山羊各组织中存在广泛表达,且在脾和肺中表达水平最高(Pklf10表达水平总体呈上升趋势;过表达klf10极显著增加了肌内脂肪细胞中脂滴的积聚;过表达klf10脂肪细胞分化标志基因C/EBPα表达水平显著上调(Pklf10后klf3、klf14和klf17的mRNA表达量极显著上调(Pklf1和klf16的mRNA的表达量也被显著上调(Pklf11的表达水平则显著下调(Pklf10后极显著降低了山羊肌内脂肪细胞中脂滴的积聚;同时干扰klf10后LPL、AP2、C/EBPα和SREBP1表达水平极显著下调(Pklf1、klf5、klf6、klf7、klf8、klf9、klf11、klf12、klf14、klf15、klf16和klf17的mRNA表达量均受到抑制极显著降低(Pklf3的表达水平则显著上调(Pklf10过表达后C/EBPα启动子活性显著增强(Pklf10基因序列,并明确了其组织与细胞时序表达特性,综合过表达和干扰结果发现klf10促进山羊肌内前体脂肪细胞分化,并且这种调控作用可能是协同该家族部分成员通过C/EBPα来实现的。

关键词：山羊 klf10 肌内前体脂肪细胞过表达干扰 C/EBPα

舒洛地特对腹膜透析大鼠腹膜组织中TGF-β1/Smad及klf10、klf15因子的作用

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舒洛地特对腹膜透析大鼠腹膜组织中TGF-β1/Smad及KLF10、KLF15因...

作者：刘利利福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】观察舒洛地特(Sulodexide SLX)对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的作用及作用机制【方法】 26只SD大鼠随机分为3组：(1)空白对照组(n=6)：未予任何处理;(2)模型组(n=10)：每日腹腔内注射4.25%PDF20mL;(3)SLX组(n=10)：每日腹腔内注射... 详细信息

【目的】观察舒洛地特(Sulodexide SLX)对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的作用及作用机制【方法】 26只SD大鼠随机分为3组：(1)空白对照组(n=6)：未予任何处理;(2)模型组(n=10)：每日腹腔内注射4.25%PDF20mL;(3)SLX组(n=10)：每日腹腔内注射4.25%PDF20mL+SLX20mg·kg。除空白对照组外其余大鼠均置入腹透管。透析8周后处死大鼠，取壁层腹膜行HE及Masson染色，光镜下观察腹膜形态改变;高倍镜下观察单位面积腹膜组织中血管及炎症细胞数;采用RT-PCR观察肠系膜Smad2、Smad3、Smad7、klf10和klf15的mRNA的变化;采用免疫组化检测壁层腹膜TGFβ1和α-SMA蛋白表达情况，采用western blot法检测脏层腹膜p-Smad2/Smad3、Smad7、klf10和klf15蛋白的表达。【结果】 1.在实验结束时一共有6只大鼠由于堵管或腹膜炎而退出最终统计，各组大鼠实验前后体重变化无明显异常(P＞0.05);2.与空白对照组相比，模型组间皮下基质明显增厚，血管增生，炎症细胞浸润明显增多(P＜0.05);SLX能改善上述的病理改变(P＜0.05);3.与空白对照组相比，模型组Smad2、Smad3、Smad7和klf10mRNA表达明显增高(P＜0.05);TGFβ1、α-SMA、p-Smad2/Smad3、Smad7和klf10蛋白表达水平明显增高(P＜0.05);klf15mRNA和蛋白表达水平均明显减低(P＜0.05);给予SLX后能明显下调Smad2、Smad3、Smad7、klf10mRNA表达水平(P＜0.05)和TGFβ1、α-SMA、p-Smad2/Smad3、Smad7和klf10蛋白表达水平(P＜0.05);上调klf15mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05)。【结论】 1.本实验成功复制了大鼠腹膜透析相关性腹膜纤维化模型;2.舒洛地特能够通过下调TGFβ1及其信号通路分子p-Smad2/3、Smad7的表达，同时下调spl/Krüppel样因子klf10及上调klf15的表达间接影响Smad分子的活性来抑制TGFβ1作用，阻止腹膜间皮细胞转分化过程，从而起到改善腹膜纤维化的作用。

关键词：腹膜透析腹膜纤维化舒洛地特大鼠 TGFβ1p-Smad2/3 Smad7 klf10 klf15

E3泛素连接酶FBW7对klf10蛋白稳定性调控及生物学功能的研究

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E3泛素连接酶FBW7对KLF10蛋白稳定性调控及生物学功能的研究

作者：于素华东师范大学

学位级别：硕士

FBW7是SCF型泛素连接酶(SKP1, Cullinl, F-Box蛋白复合物)中识别底物的元件。它能够识别底物上保守的降解信号肽(CPD)进而促进靶蛋白发生泛素化依赖的降解。它的肿瘤抑制因子的作用已经被广泛接受,越来越多的报道指出FBW7对一些原癌蛋... 详细信息

FBW7是SCF型泛素连接酶(SKP1, Cullinl, F-Box蛋白复合物)中识别底物的元件。它能够识别底物上保守的降解信号肽(CPD)进而促进靶蛋白发生泛素化依赖的降解。它的肿瘤抑制因子的作用已经被广泛接受,越来越多的报道指出FBW7对一些原癌蛋白起重要作用,在调节细胞周期、细胞生长、细胞内代谢、分化和凋亡中发挥重要作用。近年来越来越多的证据表明FBW7在控制干细胞的自我更新、分化、存活和保持干性中具有重要功能,因此对FBW7新底物的发现是对其生物学功能和它抑制肿瘤发生机制研究至关重要。klf10是Kruppel样锌指转录因子家族中的一员,它作为一个转录因子能通过其锌指结构域与DNA结合而调控一系列基因的转录。klf10也被称作TGFβ可诱导的早期基因I(TIEG1),已经有报道指出klf10可以被TGFβ,表皮生长因子和骨形成蛋白快速诱导。之前有报道指出klf10在T细胞中具有重要作用,klf10可以调节FOXP3的表达并通过与TGFβ一起作用调节CD4+CD25-T细胞和调节T细胞。klf10在先天免疫细胞如巨噬细胞中的功能也有一些研究,它可以调节一些炎症因子的产生。由于klf10在细胞分化和许多信号通路中都具有重要的作用,并且klf10是一些疾病发生的一个标志,因此对klf10的生物学功能的研究是目前生物领域的一个研究热点。在本课题的研究中,我们利用生物信息学的方法预测出klf10含有FBW7的CPD,推测klf10可能是FBW7的新的底物,进一步通过外源过表达和内源的一些实验确定了FBW7对klf10蛋白稳定性的调控。通过实验清楚了FBW7调控klf10蛋白稳定性的分子机制,即FBW7通过促进klf10的泛素化水平进而调控klf10的蛋白酶体途径的降解。通过体内体外的实验均能证明FBW7与klf10可以相互作用,通过一系列的点突变证明了klf10的CPD在FBW7对其降解过程中发挥重要作用,并更明确地指出了CPD中对磷酸化具有重要作用的氨基酸,提出了FBW7降解底物的具体分子机制。由于klf1 和klf10有很强的同源性,同时预测klf11也含有CPD,因此我们对FBW7降解klf11的分子机制也做过一些研究,但是具体的功能还没完成。本研究提出了klf10和klf11蛋白稳定性调控的新的机制,同时也为FBW7功能的研究提供了新的思路。揭示了FBW7通过调控其底物klf10和klf11的稳定性进而可能在免疫细胞中或一些疾病发生中发挥重要的作用。

关键词： FBW7 klf10 klf11 泛素化蛋白降解

EBV-miR-BART8-3p靶向klf10参与EBV易感细胞凋亡调控的作用及机制研究

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EBV-miR-BART8-3p靶向KLF10参与EBV易感细胞凋亡调控的作用及机制...

作者：刘仪彤南华大学

学位级别：硕士

爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种γ-疱疹型双链DNA病毒。全世界多数人在幼儿期就可感染EBV,易感细胞为淋巴细胞和部分粘膜上皮细胞,一旦感染即终身携带,但通常不会产生任何症状。然而,越来越多研究证明EBV与肿瘤发生... 详细信息

爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种γ-疱疹型双链DNA病毒。全世界多数人在幼儿期就可感染EBV,易感细胞为淋巴细胞和部分粘膜上皮细胞,一旦感染即终身携带,但通常不会产生任何症状。然而,越来越多研究证明EBV与肿瘤发生关系密切。本课题组前期利用EBV诱发淋巴瘤小鼠模型进行差异基因表达筛选,发现EBV-miR-BART8-3p在EBV诱发淋巴瘤中表达升高,同时发现诱发瘤中凋亡信号受到抑制,但具体靶向基因及信号途径不清。因此,本研究将对EBV-miR-BART8-3p如何参与抑制凋亡信号调控从而抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和侵袭等恶性生物学行为进行初步研究。方法1.利用RT-q PCR检测永生化淋巴细胞系(GM12878、***)及永生化胃黏膜上皮细胞(GES-1)中EBV-miR-BART8-3p的表达情况。挑选无表达EBV-miR-BART8-3p的细胞做后续实验。2.构建EBV-miR-BART8-3p慢病毒过表达载体。包装慢病毒并感染细胞,过表达EBV-miR-BART8-3p,观察细胞表型变化。3.通过miRNA-m RNA联合芯片数据、RNAinter(http://***/)及文献中芯片数据(PMID:33694159)数据分析筛选出EBVmiR-BART8-3p可能存在的靶基因,利用生信分析网站(https://bibis ***/rnahybrid?id=rnahybrid＿view＿submission)预测其结合位点。4.构建pmir GLO双荧光素酶报告基因载体,通过双荧光素酶报告基因实验验证EBV-miR-BART8-3p与其靶基因的作用。5.采用RT-q PCR验证靶向基因的m RNA及凋亡相关基因表达情况。6.使用Western blot验证靶向基因的蛋白表达情况及凋亡相关基因表达情况。7.构建过表达靶基因载体,观察细胞表型变化及凋亡相关基因表达情况。8.利用RT-q PCR检测伯基特淋巴瘤细胞系(Daudi、RAJI)及胃癌细胞系(AGS、BGC823、SGC7901)中klf10的表达情况,挑选相对低表达klf10的细胞作为后续实验。9.构建klf10的过表达pc DNA3.1载体,通过转染细胞观察细胞表型的变化。结果1.提取永生化淋巴细胞系(GM12878、***)及永生化胃黏膜上皮细胞(GES-1)RNA,RT-q PCR结果显示GM12878高表达EBV-miR-BART8-3p,***及GES-1未检测出EBV-miRBART8-3p,从而选取***及GES-1细胞进行EBV-miRBART8-3p过表达。2.选取p LVX-EGFP-IRES-Puro作为过表达EBV-miR-BART8-3p慢病毒载体,测序结果显示构建成功。在***及GES-1细胞中构建EBV-miR-BART8-3p稳定表达细胞株,通过RT-q PCR验证过表达EBV-miR-BART8-3p的***及GES-1稳定转染细胞株相对高表达。3.通过CCK-8、平板克隆、软琼脂平板克隆实验表明EBV-miRBART8-3p可以促进***及GES-1细胞的增殖及克隆形成能力。通过Transwell实验提示EBV-miR-BART8-3p促进***及GES-1细胞迁移能力。通过流式细胞术检测细胞凋亡表明在促凋亡剂tasisulam的作用下,EBV-miR-BART8-3p可以抑制***及GES-1细胞的凋亡。RT-q PCR及Western blot实验分别检测BCL-2及BAX m RNA水平及蛋白水平,实验结果显示BCL-2/BAX比例增加。4.通过m RNA-miRNA联合芯片、RNAinter预测网站、文献中芯片数据分析,筛选出可能存在的靶基因,其中包括Caspase7、Caspase9、Caspase10、klf10、MAPK11、PHKG2、DUSP3。利用RNAhybrid数据库分析以上基因与EBV-miR-BART8-3p相互结合的种子结合位点。5.选取pmir GLO载体作为双荧光素酶报告基因实验表达载体,构建靶基因目的片段及目的片段缺失的双荧光素酶报告基因表达载体,测序结果显示载体构建成功;通过双荧光素酶报告基因实验表明EBV-miR-BART8-3p可以靶向klf10。***-q PCR、Western blot结果显示稳转EBV-miR-BART8-3p的***细胞及GES-1细胞的klf10表达显著下调,具有统计学意义(P<0.001),凋亡相关指标BCL-2/BAX比例显著上调,组间差异具有统计学

关键词： EBV EBV相关肿瘤 klf10 EBV-miR-BART8-3p 凋亡

大连紫海胆klf8、klf10、klf13基因的克隆与表达及C/EBPs基因启动子活性研究

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大连紫海胆KLF8、KLF10、KLF13基因的克隆与表达及C/EBPs基因启动...

作者：毋凯凯西北农林科技大学

学位级别：硕士

大连紫海胆(Strongylocentrotus nudus)是中国重要的经济水产物种,其性腺富含多种不饱和脂肪酸。然而大连紫海胆性腺脂类物质生成和脂肪酸合成的调控机制至今仍是空白。锌指样转录因子(Krüppel-like factors,klfs)和CCAAT增强子结合蛋... 详细信息

大连紫海胆(Strongylocentrotus nudus)是中国重要的经济水产物种,其性腺富含多种不饱和脂肪酸。然而大连紫海胆性腺脂类物质生成和脂肪酸合成的调控机制至今仍是空白。锌指样转录因子(Krüppel-like factors,klfs)和CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins,C/EBPs)已经被证实在脂肪代谢中起调控作用。klfs基因家族包含17个成员,其中klf15,klf4,klf5,klf6和klf9促进脂肪形成,klf2和klf3抑制脂肪形成。C/EBPs基因家族包含6个成员(C/EBPα,C/EBPβ,C/EBPγ,C/EBPδ,C/EBPε和C/EBPζ),其在调控脂肪形成中是一个关键的转录因子。阐明大连紫海胆klfs基因的功能和C/EBPs基因的转录调控以及klfs与C/EBPs的互作调控机制,对了解大连紫海胆脂类物质形成机理的研究具有重要的意义。本研究筛选转录组中的脂类物质形成相关基因序列,设计特异性引物、构建过表达载体和逐段缺失载体,结合实时荧光定量PCR技术、Genome Walking技术、双荧光素酶报告基因实验以及生物信息学分析等,获得了大连紫海胆klf8、klf10、klf13全长cDNA和部分C/EBPs基因序列及其5`侧翼序列,分析了它们的序列特征和组织表达分布,并且对它们在脂类物质形成中的功能进行了相关的探索,得到了以下结果:1、Snklf8 cDNA全长为3954 bp,包含97 bp 5′非翻译区(Untranslated Regions,UTR)和2684 bp 3′UTR,开放阅读框1164 bp,编码387个氨基酸。Snklf10 cDNA全长为3526 bp,包含138 bp 5′UTR和1912 bp 3′UTR,开放阅读框1476 bp,编码491个氨基酸。Snklf13 cDNA全长为3756 bp,包含422 bp 5′UTR和2485 bp 3′UTR,开放阅读框894 bp,编码282个氨基酸。结构域预测表明Snklf8、Snklf10和Snklf13碳端都包含一个三联窜的锌指DNA结合结构域。2、获得了部分SnC/EBPs cDNA序列及完整的SnC/EBPs 5`侧翼序列。SnC/EBPα5`侧翼序列为1154 bp,SnC/EBPγ5`侧翼序列为1494 bp,SnC/EBPζ5`侧翼序列为823 bp。结构域预测表明SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ碳端都包含一个亮氨酸拉链结构域(Basic-leucine zipper domain,bZIP)。3、Snklf8、Snklf10、Snklf13和SnC/EBPs mRNA在雄性性腺和雌性性腺的表达量相对较高,并且在两龄和三龄雌雄性腺的mRNA表达存在差异。4、Snklf8和Snklf10过表达,检测SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ启动子的荧光活性不同程度的下降,表明Snklf8和Snklf10过表达抑制SnC/EBPs转录活性。Snklf13过表达,检测SnC/EBPα启动子荧光活性升高,SnC/EBPγ和SnC/EBPζ启动子荧光活性下降,表明Snklf13提高SnC/EBPα转录活性,抑制SnC/EBPγ和SnC/EBPζ转录活性。5、生物信息学预测SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ启动子的转录因子结合位点,进一步表明SnC/EBPs是Snklfs转录因子潜在的靶基因。6、双荧光素酶报告基因实验表明SnC/EBPα核心启动子位于-20416序列之间,SnC/EBPγ包含两个核心启动子位于-13961179序列和-742525序列之间,SnC/EBPζ核心启动子位于16409序列之间。以上实验结果表明,Snklf8、Snklf10、Snklf13和Sn C/EBPs基因参与大连紫海胆性腺脂类物质的形成,并且Snklf8、Snklf10、Snklf13发挥功能是依靠调控SnC/EBPs转录来实现的。这将为进一步理解klf8、klf10、klf13和C/EBPs基因在无脊椎动物脂类物质形成机制中的功能奠定基础。

关键词：大连紫海胆 klf8 klf10 klf13 C/EBPs(C/EBPα,C/EBPγ和C/EBPζ)