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kigamicin生物合成基因簇中orf48和orf49的功能研究

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Kigamicin生物合成基因簇中orf48和orf49的功能研究

作者：贾沙福建师范大学

学位级别：硕士

kigamicin是由Amycolatopsis sp. ML630-mF1发酵产生的一类多环氧杂蒽酮类抗生素,具有抗细菌、抗真菌和特异性抗肿瘤的活性。其特异性抗肿瘤活性表现为可特异性抑制营养饥饿状态下肿瘤细胞,而对正常状态下的细胞无抑制作用,因此可作为... 详细信息

kigamicin是由Amycolatopsis sp. ML630-mF1发酵产生的一类多环氧杂蒽酮类抗生素,具有抗细菌、抗真菌和特异性抗肿瘤的活性。其特异性抗肿瘤活性表现为可特异性抑制营养饥饿状态下肿瘤细胞,而对正常状态下的细胞无抑制作用,因此可作为特异性抗癌药物的潜在开发来源。鉴于kigamicin独特的化学结构和生物活性,人们对其结构与功能的关系产生了浓厚的研究兴趣。本研究在kigamicin生物合成基因簇成功克隆的基础上,通过分子生物学手段对其相关基因功能进行研究,可使我们进一步了解多氧环杂蒽酮类抗生素生物合成机制,为解释其独特的生物活性提供理论依据。首先,通过生物信息学分析推测kigamicin生物合成基因簇中orf48和orf49的基因功能,orf48与Xantholipin和Lysolipin生物合成基因xanK和llpK同源性较高,初步推测orf48可能编码3Fe-S Ferredoxin,参与kigamicin生物合成途径中的电子传递和氧化还原反应;orf49与Xantholipin生物合成基因xan02功能类似,有可能负责kigamicin生物合成中亚甲基双氧桥的形成;但是也可能与Lysolipin生物合成基因llpOIV相似,参与催化kigamicin中氧杂葸酮环形成前的环氧化反应。然后,通过PCR-targeting技术分别构建缺失orf48质粒和缺失orf49质粒,即分别以壮观霉素抗性基因替换质粒pLL59上的orf48和orf49,并通过抗性筛选转化子,经PCR验证后,得到突变质粒pLL214和pLL215。而后通过接合转移将突变质粒分别转入天蓝色链霉菌ML154,抗性筛选得到突变株Kiga21468和突变株Kiga21568.通过HPLC-MS检测突变株Kiga21468、Kiga21568以及野生型ML154发酵产物,结果比对,发现突变株Kiga21468和突变株Kiga21568产生了相同的物质组分,并且与kigamicin具有相同UV特征吸收峰。由此推测,突变株Kiga21468和Kiga21568可能产生kigamicin结构类似物。对突变株发酵积累代谢产物[M+H]/Z=497, [M+H]/Z=538, [M+H]/Z=527进行分离纯化和结构鉴定,化合物[M+H]/Z=538的分子式为C28H27NO10,其化学结构与kigamicin结构相比缺少亚甲基双氧桥结构,故而推测Orf48和Orf49参与了kigamicin亚甲基双氧桥结构的生物合成。

关键词： kigamicin 生物合成基因簇 PCR-targeing 基因功能

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kigamicin生物合成途径的研究

Kigamicin生物合成途径的研究

作者：黄连琴福建师范大学

学位级别：硕士

kigamicin独特的生物学活性表现为能够抑制营养饥饿状态的肿瘤细胞,而对正常营养生长状态的细胞没有影响。故而kigamicin能够作为以后开发特异性抗癌药物的重要来源。鉴于微生物代谢工程在改造和修饰途径以提高产量或产生新物质方面应用... 详细信息

kigamicin独特的生物学活性表现为能够抑制营养饥饿状态的肿瘤细胞,而对正常营养生长状态的细胞没有影响。故而kigamicin能够作为以后开发特异性抗癌药物的重要来源。鉴于微生物代谢工程在改造和修饰途径以提高产量或产生新物质方面应用,本文设计研究kigamicin的生物合成途径。为此,本文以一株产kigamicin的放线菌ML630-mF1(Amycolatopsis sp. ML630-mFl)为研究对象,从4个方面进行研究,结果如下：构建了ML630的基因组文库,筛选并获得了3个柯斯质粒Fos2、Fos4、Fos7。推测可能的kiga基因簇全长约为93kb,包含74个开放阅读框(ORF),其中只有Fos4同时含有最基本的聚酮合酶基因以及与含氮杂环形成的基因,最有可能异源表达出kigamicin或其结构类似物。 pLL59在Steptomyces lividans K4中的异源表达及其表达产物的分离纯化。pLL59导入异元表达宿主Streptomyces lividans K4,同时导入含有激活因子的质粒pLL68,获得突变株LQ5968。ML630与LQ5968发酵产物的LC-MS检测结果比较,二者同时表达了与kigamicin具有相同UV吸收光谱、[M+H]/Z为538和552的组分。其中[M+H]/Z为552的组分与文献报道的kigamicin糖苷配基一致;[M+H]/Z为538的组分推测其可能为kigamicin的结构类似物。固体R5平板发酵LQ5968,并利用乙酸乙酯萃取、反向硅胶柱层析初步分离LQ5968的发酵产物。然后经过LC-MS检测,根据保留时间先后依次为LQ-1、LQ1-1、LQ-2、LQ-3、LQ-4、LQ4-1.这个6个组分与kigamicin D具有相同的UV吸收光谱,[M+H]/Z分别为497、512、552、538、494、538。 kigamicin生物合成途径的初步研究。克隆minimal PKS的基因并构建表达质粒pLQ10,导入异元表达宿主天蓝色链霉菌M1152,,结果未检测到新产物。构建含有调节因子orf29和orf24的表达质粒pLQ18和pLQ22,导入突变株LQ59中并检测发酵产物,结果反而检测不到pLL59表达产物。构建含有羟化酶基因orf67的质粒pLQ7,导入突变株LQ59中并检测发酵产物,结果表明新的突变株并没有产生其他新物质。

关键词： kigamicin 抗肿瘤 typeⅡ PKS 氧杂蒽酮生物合成

kigamicin生物合成基因簇中orf60的研究

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Kigamicin生物合成基因簇中orf60的研究

作者：李思洋福建师范大学

学位级别：硕士

kigamicin是从放线菌中分离到的具有抗细菌和抗肿瘤活性的天然产物。其独特的生物学活性表现为能够抑制营养饥饿状态的肿瘤细胞,而对正常营养生长状态的细胞没有影响。因此,kigamicin可以作为开发特异性抗癌药物的重要来源。本论文通过... 详细信息

kigamicin是从放线菌中分离到的具有抗细菌和抗肿瘤活性的天然产物。其独特的生物学活性表现为能够抑制营养饥饿状态的肿瘤细胞,而对正常营养生长状态的细胞没有影响。因此,kigamicin可以作为开发特异性抗癌药物的重要来源。本论文通过对kigamicin的生物合成途径的研究,而研究过程中着重阐明kigamicin合成过程中新物质的化学结构。从而进一步了解kigamicin的化学结构与功能上的对应关系。为了研究orf60在kigamicin的生物合成中的功能,本论文开展了以下工作：首先,我们对orf0基因进行生物信息学分析,推测其编码的蛋白可能是一种单加氧酶。然后我们以PIJ778为模板采用PCR技术扩增出一段与orf60两端同源且带有壮观霉素抗性的置换片段。随后将这段置换片段以及整合型质粒pLL59一起转化到*** BW25113/pIJ 790中,通过PCR-Targeting技术我们得到重组质粒并命名为pLL200,通过抗性筛选以及PCR验证,证明orf0基因敲除成功。然后,我们将重组质粒pLL200以及质粒pLL68(含有激活因子)转入天蓝色链霉菌ML154,通过孢子接合转移方法得到了突变菌株ML20068。通过对比突变株M120068和野生株ML154发酵产物HPLC-MS的检测结果,发现突变株ML20068产生了[M+H]/Z=538 和 [M+H]/Z=513的两个新组分。它们与kigamicin具有相同UV吸收光谱。它们可能是kigamicin生物合成过程中的中间产物或衍生物。我们通过对发酵产物分离纯化得到538组分12.6 mg和513组分9.0 mg。高分辨质谱拟合它们的元素组成,确定538组分的分子式为C 28H27NO10,513组分的分子式为(26H24O11最后通过核磁共振解析其化学结构,我们得到了538组分的化学结构。从而推测orf60在kigamicin的生物合成中的功能。

关键词： kigamicin 生物合成路径 PCR-Targeting

Anticancer potential of metabolic compounds from marine actinomycetes isolated from Lagos Lagoon sediment

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Journal of Pharmaceutical Analysis 2019年第3期9卷 201-208页

作者： Olabisi Flora Davies-Bolorunduro Isaac Adeyemi Adeleye Moshood Olushola Akinleye Peng George Wang Department of Microbiology University of Lagos Akoka Lagos Nigeria Department of Pharmaceutical Chemistry University of Lagos Idi-Araba Lagos Nigeria Department of Chemistry Georgia State University Atlanta GA United States

Thirty-two actinomycetes strains were isolated from sediment samples from 12 different sites at Lagos Lagoon and identified using standard physiological and biochemical procedures as well as 16S rDNA gene sequence analysis. Secondary metabolites were extracted from the strains and their anticancer activity on the K562 (Human acute myelocytic leukemia), HeLa (cervical carcinoma), AGS (Human gastric), MCF- 7 (breast adenocarcinoma) and HL-60 (Human acute promyelocytic leukemia) cell lines was determined. The metabolic extracts exhibited cytotoxicity with IC50 values ranging from 0.030 mg/mL to 4.4 mg/mL. The Streptomyces bingchenggensis ULS14 extract was cytotoxic against all the cell lines tested. The bioactivity-guided extraction and purification of the metabolic extracts from this strain yielded two purified anticancer compounds: ULDF4 and ULDF5. The structures of the extracted compounds were determined using spectroscopic analyses, including electrospray ionization mass spectrophotometer and nuclear magnetic resonance (1 Dimensional and 2 Dimensional), and were shown to be structurally similar to staurosporine and kigamicin. The IC50 of ULDF4 and ULDF5 against the HeLa cell line was 0.034 mg/mL and 0.075 mg/mL, respectively. This study is the first to reveal the anticancer potential of actinomycetes from Lagos Lagoon, which could be exploited for therapeutic purposes.

关键词： Streptomyces bingchenggensis ULS14 Metabolic extracts Cytotoxicity Spectroscopy kigamicin Staurosporine