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keap1/Nrf2信号通路在铜绿假单胞菌脂多糖上调气道粘蛋白MUC5AC表达中的作用

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Keap1/Nrf2信号通路在铜绿假单胞菌脂多糖上调气道粘蛋白MUC5AC表...

作者：林晓萍浙江大学

学位级别：硕士

正常情况下气管、支气管上皮细胞和粘膜下腺分泌的粘液是机体固有免疫的重要组成部分,它对入侵气道的各种异物、病原体具有屏障、清除作用。但在病理情况下,过度分泌的粘液是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary dise... 详细信息

正常情况下气管、支气管上皮细胞和粘膜下腺分泌的粘液是机体固有免疫的重要组成部分,它对入侵气道的各种异物、病原体具有屏障、清除作用。但在病理情况下,过度分泌的粘液是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)、支气管扩张、囊性纤维化(Cystic fibrosis, CF)等慢性气道疾病发病、死亡的常见原因,目前仍缺乏有效的治疗手段。阐明气道粘液合成的调控机制,将为气道粘液高分泌提供新的治疗靶点,对开发有效抑制气道粘液高分泌的新药物具有重要意义。粘蛋白MUC5AC是气道粘液的主要成分,所以研究其表达的调控机制尤为重要。多种细菌均可诱导气道粘蛋白MUC5AC表达上调,包括致呼吸道感染的常见细菌--铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)及其胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),但目前PA-LPS上调气道粘蛋白MUC5AC表达的分子机制尚未完全阐明。最近有研究发现活性氧(Reactive oxygen species, ROS)可通过TACE→TGF-α→EGFR信号通路介导香烟烟雾、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase, NE)上调气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC的表达;本实验室既往研究发现可能存在TLR4-PKC-Duox1信号通路调控PA-LPS诱导的气道上皮细胞ROS合成,进而通过ROS及其下游的信号通路TACE-TGF-α-EGFR调控粘蛋白MUC5AC的表达。以上研究提示氧化应激在PA-LPS诱导气道MUC5AC高表达中具有重要作用。核因子相关因子2 (NF-E2-related factor2, Nrf2)是细胞抗氧化应激反应的调节中枢,其活性主要由keap1 (Keleh-like ECH-associated protein 1)负性调节。生理状态下,Nrf2与keap1相耦联,后者与胞浆肌动蛋白结合而被锚定在胞浆,通过泛素介导的蛋白降解系统维持Nrf2的基础水平;而在氧化应激作用下,Nrf2与keap1解耦联、转移入核,与其专性伴侣--小Maf蛋白结合成异二聚体,识别并结合抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)上GCTGAGTCA位点,启动ARE调控的抗氧化酶基因,如：谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST)、NADP(H)醌氧化还原酶INADP(H):quinine oxidoreductase, NQO1】、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位【catalytic subunits of y-glutamylcysteine ligase(GCLc)】及血红素氧化酶1 (heme oxygenase-1, HO-1)等表达,增加细胞对氧化应激的抗性。近年来大量研究显示keap1/Nrf2信号通路参与了肿瘤、老化、哮喘、急性肺损伤、肺纤维化、动脉粥样硬化、神经退行性变、慢性炎症和自身免疫病等疾病的病理生理过程。既往研究表明化学合成的三萜化物CDDO,通过增强Nrf2活性、抑制NF-K B活化,可以减轻LPS诱导的肺囊性纤维化小鼠模型的气道炎症;在Nrf2敲除的实验性败血症小鼠模型中,LPS刺激30分钟内,小鼠肺部炎症加重、大量与天然免疫反应有关的前炎症因子产生,感染性休克的死亡率明显增高。上述研究虽表明keap1/Nrf2信号通路能有效抑制LPS诱导的肺部炎症,但对于该信号通路是否参与调控PA-LPS诱导气道MUC5AC表达目前国内外未有报道。本课题拟以气道上皮细胞A549为研究对象,研究keap1/Nrf2信号通路在PA-LPS上调气道MUC5AC中的作用,以阐明氧化应激调节PA-LPS诱导气道粘蛋白MUC5AC表达的机制。第一部分：铜绿假单胞菌脂多糖诱导人体气道上皮细胞系A549细胞MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1)的表达目的：探讨铜绿假单胞菌脂多糖(PA-LPS)诱导A549细胞粘蛋白MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1)表达。方法：不同浓度(5ug/mL、10 ug/mL和15 ug/mL)PA-LPS干预体外培养的A549细胞不同时间(Oh、8h、12h、24h),用实时荧光PCR(Q-PCR)分别检测干预后MUC5AC mRNA的表达水平,以明确PA-LPS是否能上调A549细胞MUC5AC的表达,以及PA-LPS最佳干预浓度和时间。干预24h后采用Western Blot检测MUC5AC以及抗氧化因子蛋

关键词：铜绿假单胞菌脂多糖粘蛋白MUC5AC Nrf2 keap1 A549细胞

keap1-Nrf2-ARE信号通路在声门上型喉鳞状细胞癌中的表达及意义

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Keap1-Nrf2-ARE信号通路在声门上型喉鳞状细胞癌中的表达及意义

作者：杨菲河北医科大学

学位级别：硕士

目的：喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,病理类型93%-99%为鳞状细胞癌。喉癌中以声门上型和声门型最多见，而声门上型喉癌预后较差,且淋巴结转移率高。喉癌的发生、发展及浸润转移是一个多基因、多阶段和多因素参与的过程，研究喉癌的发生... 详细信息

目的：喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,病理类型93%-99%为鳞状细胞癌。喉癌中以声门上型和声门型最多见，而声门上型喉癌预后较差,且淋巴结转移率高。喉癌的发生、发展及浸润转移是一个多基因、多阶段和多因素参与的过程，研究喉癌的发生以及发展机制，对于临床有效的防治具有非常重要意义。尤其在当前肿瘤治疗寄希望于靶向生物治疗有重大突破时，各国学者专注于寻找各个癌瘤不同的基因靶点，尤为特征性、通路性靶点，为临床治疗提供理论依据。此类研究是当前学界热门。因此本研究通过keap1-Nrf2-ARE信号通路在声门上型喉鳞状细胞癌中的表达，探讨其临床意义。细胞信号传导以及调控的异常与肿瘤的发生、发展密切相关，同时通过对信号转导途径的干预从而达到治疗肿瘤的目的已经成为生物治疗的一个新领域。其中，keap1-Nrf2-ARE信号通路在预防肿瘤的形成、抵抗氧化攻击中发挥着重要作用。同时也是机体防御致癌物刺激，对细胞氧化还原平衡维持的一种重要机制。但该信号通路一旦遭到破坏，出现传导或调控异常，将会导致Nrf2过度的激活，引起多种下游基因的过表达,进而增加了细胞对致癌物的敏感性，促进了癌细胞的生长、癌变的发生。同时也可增强癌细胞的防御能力。研究表明，Nrf2/keap1在多种实体肿瘤中被持续激活，异常调节细胞。在人类恶性肿瘤的发生、发展和演进中起着重要作用。但该通路在喉癌中的研究尚未见报道。因此本研究拟采用免疫组织化学方法观察声门上型喉鳞状细胞癌组织中Nrf2、keap1和ARE的表达，分析keap1-Nrf2-ARE信号通路在声门上型喉鳞状细胞癌中的表达与临床参数的关系及其相关性，探讨其临床意义。方法：采用免疫组织化学染色（MaxVision法），选择声门上型喉鳞状细胞癌组织73例，正常喉粘膜组织12例作为对照。检测癌组织及正常对照组中Nrf2、keap1及ARE的表达情况。结果：1keap1的表达keap1的阳性染色部位定位于细胞质，以胞质内出现淡黄色及棕褐色颗粒为阳性细胞。keap1在正常喉粘膜组织高表达率明显高于声门上型喉鳞状细胞癌（75.0%vs23.3%），差异有统计学意义（Pkeap1在喉癌组的表达与临床分期有关，临床分期越晚，keap1的表达越强，Ⅲ、Ⅳ期喉癌组的表达率(33.3%)高于I、Ⅱ期喉癌组(9.7%，Pkeap1在喉癌组织中的表达与年龄、性别、吸烟量、肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移间无明显相关性（P>0.05）。2Nrf2的表达Nrf2阳性染色部位主要定位于细胞核，散见于细胞质中，着色为棕黄色至棕褐色。Nrf2在声门上型鳞状细胞癌中的高表达率（53.4%）明显高于正常喉粘膜组织（16.7%，P＜0.05）。Nrf2在低、中、高分化癌组织组中的高表达率分别为81.8%、45.5%和28.6%，Nrf2的表达随喉癌分化程度升高而降低。（P0.05）。3ARE的表达ARE的阳性染色部位为细胞核，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。ARE在声门上型鳞状细胞癌及正常喉粘膜组织中均可见少部分高表达，分别为26.0%和33.3%，声门上型鳞状细胞癌组高表达率与正常喉粘膜组的差异无统计学意义（P>0.05）。ARE在癌组织中的表达与病理学分级、淋巴结转移、临床分期、年龄、性别、吸烟量、肿瘤大小无明显相关性（P>0.05）。4声门上型喉鳞状细胞癌中Nrf2、keap1及ARE表达量之间的关系Nrf2与keap1的表达存在负相关关系（r=-0.330，P=0.004），Nrf2与ARE的表达无相关关系(r=0.116，P=0.330)，keap1与ARE的表达无关(r=-0.313，P=0.792)。结论：1keap1-Nrf2-ARE信号通路的异常可能参与声门上型喉鳞状细胞癌的发生、发展过程。2声门上型喉鳞状细胞癌中，Nrf2的表达与肿瘤分化程度相关，Nrf2的表达随分化程度降低而增高，Nrf2的表达与淋巴结转移呈正相关。3声门上型喉鳞状细胞癌中,keap1的表达与临床分期相关,临床分期越晚，keap1的表达越强。4ARE在声门上型喉鳞状细胞癌及正常喉粘膜组织中均可见少部分高表达，但差异无统计学意义。5声门上型喉癌中keap1与Nrf2的表达存在负相关关系;Nrf2与ARE的表达无相关关系;keap1与ARE的表达无关。

关键词：声门上型喉鳞状细胞癌 Nrf2 keap1 ARE 信号通路免疫组化

keap1介导的细胞骨架重排在砷致人支气管上皮细胞恶性转化中的机制研究

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KEAP1介导的细胞骨架重排在砷致人支气管上皮细胞恶性转化中的机...

作者：刘怡葶中国医科大学

学位级别：硕士

目的:砷暴露是世界性公共卫生问题,可以引起人体多系统、多器官损害。大量流行病学证据表明慢性砷暴露导致肺癌发生。正常细胞转变为癌细胞的过程中会发生细胞骨架重排、细胞间黏附降低以及细胞迁移和侵袭能力增强等一系列动态变化。细... 详细信息

目的:砷暴露是世界性公共卫生问题,可以引起人体多系统、多器官损害。大量流行病学证据表明慢性砷暴露导致肺癌发生。正常细胞转变为癌细胞的过程中会发生细胞骨架重排、细胞间黏附降低以及细胞迁移和侵袭能力增强等一系列动态变化。细胞迁移需要在细胞前缘形成突起和伪足,这主要依赖于细胞骨架重排。Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,keap1)可以通过双甘氨酸重复区与肌动蛋白直接结合,作为肌动蛋白结合蛋白发挥功能,但其对细胞骨架重排的影响尚不明确。本研究建立了长期低剂量无机砷(Inorganic arsenic,i As)暴露的人支气管上皮细胞恶转模型,从细胞骨架重排角度入手,探索keap1在砷所致细胞恶性转化中的可能作用与机制,为砷所致肺癌的防治靶点提供新思路。研究方法:1、细胞及其处理:人支气管上皮细胞系BEAS-2B、HBE、16HBE及人肺腺癌细胞系H1975、PC-9、A549和H441均源于ATCC细胞库,按说明书培养。长期砷暴露BEAS-2B细胞使用含0.1μM亚砷酸钠的培养液连续处理36周,其对照组为代数匹配的非砷处理细胞。2、细胞内暴露剂量及恶转表型分析:在砷暴露不同周数收集细胞,使用电感耦合等离子体质谱仪测定细胞内砷含量,倒置显微镜观察细胞形态,通过细胞计数及流式细胞术检测细胞增殖情况,划痕愈合实验检测细胞迁移能力。3、蛋白与m RNA水平测定:利用Western blot检测keap1、NRF2及其下游相关基因蛋白水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测keap1、GCLC、GCLM的转录水平。4、蛋白数据库检索:通过检索The Human Protein Atlas数据库,分析keap1蛋白在肺癌中的表达情况。5、keap1过表达(keap1-OE)细胞系建立:使用携带靶向keap1过表达的慢病毒(keap1-OE)与携带空载体的对照病毒(Vector)分别转染BEAS-2B细胞。6、细胞骨架重排情况:通过免疫荧光法检测微丝荧光强度和伪足形态。7、干预实验:使用终浓度10μM肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D(Cytochalasin D,Cyt D)预处理细胞2 h,使用2μM Cyt D与细胞共培养24 h后进行相应检测。7、统计分析:使用Graph Pad Prism5.0软件进行数据分析。结果:1、长期无机砷暴露诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化:0.1μM无机砷暴露24 h和36周使细胞内砷含量显著升高。砷暴露24和36周细胞形态出现类梭形和菱形样改变,细胞增殖能力和迁移能力显著增强(Pkeap1的蛋白水平下降(P16HBE相比,肺腺癌细胞系H1975、PC-9、A549、H441同样观察到keap1表达水平降低。3、无机砷暴露36周的BEAS-2B细胞keap1蛋白表达水平下调(P12、18、24、30和36周BEAS-2B细胞的keap1蛋白水平随砷暴露时间的增加而下降(P12、18、24、30和36周的BEAS-2B细胞NRF2及其下游GCLC、GCLM的蛋白水平随砷暴露时间增加而升高(Pkeap1过表达抑制BEAS-2B细胞骨架重排:相比于对照组,keap1过表达组F-actin荧光强度显著下降(P1、长期无机砷暴露会导致人支气管上皮细胞发生恶性转化。2、长期无机砷暴露可能通过下调肌动蛋白结合蛋白keap1,促进细胞骨架重排,从而导致细胞恶性转化。3、keap1过表达抑制BEAS-2B细胞骨架重排。

关键词：砷肺癌恶性转化 keap1 细胞骨架重排

keap1单抗制备及其在keap1-Nrf2通路调控EIAV复制研究中的应用

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Keap1单抗制备及其在Keap1-Nrf2通路调控EIAV复制研究中的应用

作者：马官芹中国农业科学院

学位级别：硕士

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是感染马属动物的一种慢病毒,以引起感染马反复发热、持续性感染、强烈炎性应答为特征。与其他慢病毒不同的是,大多数EIAV感染马可长期处于隐性的病毒携带状态,获得了宿主对病毒... 详细信息

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是感染马属动物的一种慢病毒,以引起感染马反复发热、持续性感染、强烈炎性应答为特征。与其他慢病毒不同的是,大多数EIAV感染马可长期处于隐性的病毒携带状态,获得了宿主对病毒的免疫控制。因此,EIAV可为慢病毒天然免疫调控研究提供重要模型,蕴含天然免疫调控慢病毒感染及建立保护性免疫的关键信息。因此,对于宿主是如何获得对病毒免疫控制机制的充分认知,对于促进慢病毒和天然免疫调控的理解具有重要意义。我们的前期研究发现,EIAV感染靶细胞后,除了可以引起经典的抗病毒信号通路转录水平上调外,Nrf2(转录因子NFE2相关因子2)抗氧化通路的相关基因表达也显著上调。该结果提示,keap1-Nrf2抗氧化通路可能参与EIAV感染的调控,基于目前的研究进展,我们推测EIAV与Nrf2通路的互作蕴含着宿主对EIAV炎症调控及免疫控制的重要信息。鉴于此,本研究以EIAV作为慢病毒的模式病毒,以keap1-Nrf2抗氧化通路为研究对象,系统地研究了EIAV与Nrf2通路调控的分子机制。为了保证实验的顺利开展,首先利用本实验室成熟的单克隆抗体制备技术获得了马keap1单抗,该抗体可以检测到过表达的keap1蛋白,并且也可检测识别人源以及马源细胞的内源性keap1蛋白,具有较高的特异性和敏感性,弥补了马keap1单抗的缺失,可用于后续分子机制的研究。随后,通过转录组学及Real-time PCR等方法明确了EIAV感染靶细胞后对keap1-Nrf2通路的激活作用。并利用ARE-Luc激活系统对EIAV编码蛋白进行筛选,发现EIAV-Rev是激活Nrf2-ARE抗氧化通路的靶蛋白。在此基础上,我们进行了过表达、敲除Nrf2以及使用激动剂诱导内源性Nrf2表达等多种方式探讨Nrf2通路激活后对EIAV复制的影响,发现激活keap1-Nrf2通路可抑制EIAV的复制。进一步研究发现,Rev和Nrf2的负调控因子keap1具有结合作用,且keap1不影响Rev在细胞内的表达。通过激光共聚焦及蛋白质的核质分离实验发现,keap1可以与Rev结合将其靶定于细胞质中,限制Rev核质穿梭的能力。通过EIAV假病毒感染、RNA的核质分离提取以及Real-time PCR等方法进一步证实keap1影响了Rev介导的RRE依赖的m RNA的转运,进而抑制了病毒粒子的合成。本研究首次发现了keap1-Nrf2通路可以从两个方面调控EIAV的感染。综上所述,本研究成功制备出了马keap1单克隆抗体,发现了keap1-Nrf2通路是通过识别EIAV-Rev而被激活,明确了由于Rev和keap1的结合改变了Rev在细胞内的定位,影响了Rev的核质穿梭能力及对病毒m RNA的转运能力,从而抑制了EIAV复制的分子机制。本研究不仅阐释了EIAV与Nrf2抗氧化通路调控的分子细节,解析了Nrf2通路抑制EIAV复制的分子机制,也为进一步探讨宿主对EIAV的天然免疫控制奠定了重要基础。

关键词： keap1 马传染性贫血病毒 Nrf2-ARE抗氧化通路 Rev

keap1蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其与术后预后相关性的研究

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Keap1蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其与术后预后相关性的研究

作者：刘凯郑州大学

学位级别：硕士

研究背景食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率位列全球恶性肿瘤的前10位。在我国,食管癌属于高发肿瘤,且流行病学调查显示其发病率和死亡率具有明显的地域性差异性。从组织病理学角度分型,食管癌主要分为食管鳞状细胞癌(esophageal squ... 详细信息

研究背景食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率位列全球恶性肿瘤的前10位。在我国,食管癌属于高发肿瘤,且流行病学调查显示其发病率和死亡率具有明显的地域性差异性。从组织病理学角度分型,食管癌主要分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)两种。这两种类型食管癌的发生机制、流行病学特征以及预后不完全相同,应该采取不同的预防和治疗策略。目前,我国食管癌的发病以ESCC为主,所占比例高达90%以上。食管癌的发生发展是一个多因素参与、多步骤发展、进行性演进的过程,一般都要经历正常食管粘膜、基底细胞过度增生、不典型增生、原位癌、浸润性癌到转移癌等病理过程。当前,在治疗方面,手术治疗是食管癌的主要方式,然而由于多方面原因,患者5年生存率很低,预后较差。因此研究如何预防食管癌的发生、提高治疗疗效、改善患者预后,具有重大意义。研究表明,在恶性肿瘤的发生发展过程中,一个重要的环节在于致癌物或氧化应激对细胞,尤其是对DNA的损伤,如外界应激不能及时解除并修复损伤,最终将导致原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活,从而引起细胞的癌变。最新研究表明,由胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated proteinl, keapl)>核因子E2相关因子2 (nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)和抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)三部分组成的keap1-Nrf2-ARE信号通路(keap1-Nrf2-ARE signaling pathway)是细胞应对氧化应激的重要通路。其通过启动Ⅱ相代谢酶清除氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)保护正常细胞,对外源性致癌物质进行解毒,起到预防肿瘤发生的作用。然而,在恶性肿瘤中,此通路的激活不仅保护正常细胞,同时可以保护肿瘤细胞免受放化疗的侵袭,从而使肿瘤细胞发生耐药而促进肿瘤生长。正因为keap1-Nrf2-ARE信号通路在肿瘤中的双重作用,使之成为近年来肿瘤研究中的一大热点。keap1作为keap1-Nrf2-ARE信号通路中稳定Nrf2的阻遏蛋白,是本信号通路激活的“分子开关”。多项研究表明,keap1与非小细胞肺癌、结直肠癌、肝癌、胆囊癌、乳腺癌、头颈部鳞癌等多种恶性肿瘤有关,但目前尚无keap1与食管鳞癌相关性的报道,因此阐明keap1蛋白在食管鳞癌中的表达及其与患者预后之间的联系,可以为食管癌的预防、诊断、治疗和预后判断提供帮助。目的检测keap1蛋白在食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,分析其与患者临床病理特征、患者预后之间的关系,为食管鳞癌的诊断、治疗及判断预后提供帮助。方法收集河南省肿瘤医院胸外科2008年01月至2009年12月接受手术治疗的食管鳞癌患者手术标本共62例,均经病理学检查并经复核后证实为食管鳞状细胞癌,且患者术前未接受放化疗等抗肿瘤治疗。另随机选取34例距食管癌组织边缘5cm以上的食管组织,病理证实无肿瘤细胞浸润,作为正常对照组织。应用免疫组织化学方法检测管鳞癌组织及癌旁正常组织石蜡标本中keap1蛋白的表达情况,并对患者术后治疗和生存期进行随访。62例患者中,26例未行术后治疗,36接受了术后辅助化疗。接受术后辅助化疗的患者中,铂类联合氟尿嘧啶类方案化疗32例,其他类型方案4例;13例接受4周期化疗,8例接受3周期化疗,12例接受2周期化疗,3例接受1周期化疗。62例患者全部获得随访,中位随访时间56个月,最短随访时间6个月,最长随访时间76个月。实验数据应用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计数资料组间比较采用卡方检验或Fisher精确检验,生存分析采用Kaplan-Meier法和Cox回归模型分析,以Log-Rank法进行差异性检验。结果以Pkeap1蛋白在食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中的表达keap1蛋白在食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织均表达,且主要定位于细胞浆中,呈团块状或颗粒状分布,染色为棕黄色至棕褐色。keap1在食管鳞癌组织中阳性率为25.8%(16/62),癌旁正常组织阳性率为50.00%(17/34), keap1在癌旁正常食管组织中阳性率显著高于食管鳞癌组织,差异具有统计学意义(Pkeap1蛋白在不同食管鳞状细胞癌亚组患者中的表达差异keap1蛋白的表达与患者性别、年龄、肿瘤发生的部位、大体病理形态、分化程度及肿瘤TNM分期之间无关(P>0.05),与肿瘤浸润深度和局部淋巴结是否转

关键词：食管鳞状细胞癌 keap1 辅助化疗预后

山桃稠李果实花色苷对Nrf2/keap1通路的影响

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食品工业科技 2014年第6期35卷 116-118,124页

作者：刘荣姜元松辛越王蕾杨巍巍东北林业大学黑龙江哈尔滨150040

目的:探讨山桃稠李果实花色苷对Nrf2/keap1通路的影响。方法:质量浓度为0.05、0.2、0.8mg/mL的山桃稠李果实花色苷分别作用于HepG2细胞24、48、72h,MTT法检测对HepG2细胞生长抑制率,检测各组细胞内谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽硫转移酶(... 详细信息

目的:探讨山桃稠李果实花色苷对Nrf2/keap1通路的影响。方法:质量浓度为0.05、0.2、0.8mg/mL的山桃稠李果实花色苷分别作用于HepG2细胞24、48、72h,MTT法检测对HepG2细胞生长抑制率,检测各组细胞内谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽硫转移酶(GSH-ST)、磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)活性变化;实时荧光定量RT-PCR实验方法检测山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞的Nrf2、keap1、GSTP1的基因表达的影响。结果:随着花色苷质量浓度的增加,HepG2细胞的谷胱甘肽(GSH)含量下降,谷胱甘肽硫转移酶(GSH-ST)、磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)活性显著降低;Nrf2、keap1、GSTP1的基因表达下调。结论:山桃稠李果实花色苷能够通过对Nrf2/keap1通路的调节来降低HepG2细胞的抗氧化能力。

关键词：山桃稠李花色苷 HepG2细胞 Nrf2 keap1

keap1/Nrf2/HO-1与动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者预后关系的相关性研究

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Keap1/Nrf2/HO-1与动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者预后关系的相关性...

作者：杜自力遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:分析脑脊液中keap1（14）Nrf2（14）HO-1与a SAH患者预后的关系,以期寻找能评估a SAH术后预后结果的生物学标志物。方法:收集15例a SAH和6例未破裂动脉瘤患者术后第1天和第3天的脑脊液标本,采用DIA技术进行蛋白质组定量,筛选出差... 详细信息

目的:分析脑脊液中keap1（14）Nrf2（14）HO-1与a SAH患者预后的关系,以期寻找能评估a SAH术后预后结果的生物学标志物。方法:收集15例a SAH和6例未破裂动脉瘤患者术后第1天和第3天的脑脊液标本,采用DIA技术进行蛋白质组定量,筛选出差异表达基因keap1、Nrf2、HO-1。使用双抗体免疫吸附法Elisa测定keap1、Nrf2、HO-1的表达量;在术后3个月时通过电话或门诊进行随访,使用格拉斯哥预后评分量表（Glasgow Outcome Score,GOS）进行预后评估,其中预后良好组11人,预后不良组4人,收集数据进行统计学分析。结果:（1）预后不良组入院改良Fisher分级、Hunt-Hess分级、血常规中白细胞计数、脑脊液常规生化检查中葡萄糖含量以及总细胞计数均高于预后良好组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）在a SAH与未破裂动脉瘤患者术后第1天和第3天脑脊液中Nrf2、HO-1表达量明显高于未破裂动脉瘤组,差异具有统计学意义（P＜0.05）,而keap1的表达量无明显差异（P＞0.05）。（3）预后不良组与预后良好组相比,术后第1天脑脊液Nrf2、HO-1表达量均与预后呈显著正相关（P＜0.05）,术后第3天未见显著相关。而脑脊液中keap1表达量与预后未见显著相关性（P＞0.05）。结论:（1）入院Hunt-Hess分级、改良Fisher分级、白细胞计数、脑脊液中葡萄糖含量以及总细胞计数在预后良好与不良组差异具有统计学意义,与患者的预后相关。（2）破裂动脉瘤患者脑脊液中Nrf2、HO-1表达较未破动脉瘤患者明显升高。（3）破裂动脉瘤患者术后第1天脑脊液中Nrf2、HO-1表达量与患者的GOS评分呈正相关,是评价患者预后的潜在指标。

关键词：动脉瘤性蛛网膜下腔出血早期脑损伤 Nrf2 keap1 HO-1

冬凌草甲素对小鼠急性肝损伤保护作用的研究及keap1第四外显子突变位点的筛查

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冬凌草甲素对小鼠急性肝损伤保护作用的研究及Keap1第四外显子突...

作者：高华河南大学

学位级别：硕士

背景Nrf2/keap1信号通路对于细胞抵御外来有害氧化应激刺激非常重要。Nrf2是细胞核转录因子,控制表达和协调诱导一系列编码去毒酶和抗氧化蛋白的防御基因。在内环境稳态下,Nrf2在胞浆中与其抑制因子keap1结合,处于功能抑制状态。当细胞... 详细信息

背景Nrf2/keap1信号通路对于细胞抵御外来有害氧化应激刺激非常重要。Nrf2是细胞核转录因子,控制表达和协调诱导一系列编码去毒酶和抗氧化蛋白的防御基因。在内环境稳态下,Nrf2在胞浆中与其抑制因子keap1结合,处于功能抑制状态。当细胞受到氧化应激刺激时,Nrf2从keap1中脱离并以稳定状态进入细胞核内,与未知蛋白质结合为异二聚体,并与ARE即抗氧化反应元件相结合促进其下游基因的转录和表达,对细胞和组织起到保护作用。我们经研究发现冬凌草甲素不但可以启动Nrf2下游基因的转录,并对小鼠急性肝损伤有保护作用。正常情况下keap1可将Nrf2带入泛素通路而对其进行降解,当keap1发生基因突变时将无法降解Nrf2,从而导致Nrf2在细胞核内的聚集。有研究表明,在肺癌、乳腺癌及膀胱癌中有因keap1突变使其功能的失活无法降解Nrf2,导致新陈代谢酶的活化及抗药性的产生。越来越多的实验证据表明在几种肿瘤中因为先天的或后天的机制使Nrf2持续性激活,而使肿瘤得以生存及分化。最初的报道揭示在H1184和H1648肺癌细胞系中keap1的错义突变导致抑制Nrf2功能的丧失。随后,在54例非小细胞肺癌中及12例细胞系中分别确定出10例和6例keap1的错义突变、插入和缺失。重要的是报道这些突变导致了Nrf2的持续激活。而且keap1的突变经常伴随基因座的杂合缺失,说明在非小细胞肺癌中keap1的等位基因的缺失很常见。后来更多的keap1的突变被确定,其中腺癌29例中有3例,大细胞癌2例中有1例,小细胞肺癌8例中有1例。有项研究表明在人Q293乳腺癌细胞系中包含一个失活的keap1蛋白。在胆道肿瘤病人中也发现有突变,13例胆囊癌病人中有4例发现有keap1突变。这些结果说明keap1因突变导致的失活除了在肺癌中发生,也存在其他肿瘤中。我们通过对人食管癌keap1第四外显子的扩增及测序,发现一个同义突变位点。此同义突变位点可能对keap1的功能没有影响,但其他外显子中有无突变目前尚无报道。目的验证Nrf2/keap1信号通路对于急性肝损伤有至关重要的保护作用。并通过对食管癌keap1第四外显子的突变位点的检测,来证实keap1基因突变是否存在于食管癌中。方法将C57BL/6小鼠40只随机分为四组:对照组、低剂量冬凌草甲素组、中剂量冬凌草甲素组、大剂量冬凌草甲素组,构建不同保护模型。通过经胃给予对照组C57BL/6小鼠0.05ml PEG400、后三组给予灌注相同浓度(400μg/mL)不同剂量冬凌草甲素(分别为1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)4周后,再共同灌注56度红星二锅头(0.1ml/10g)1周后处死取材,检测小鼠肝功AST、ALT水平是否有差异;并取小鼠肝脏行HE染色,光镜下观察肝脏病理变化,了解肝脏损伤情况。另外取36例人食管癌组织及癌旁组织提取基因组DNA,并以此为模板扩增keap1第4外显子。得到目的片段后,经过纯化后直接行序列测定并与正常序列比对,查找基因突变位点。结果冬凌草甲素能通过Nrf2/keap1信号通路,降低酒精对小鼠肝脏的损伤。人食管癌keap1的第四外显子中发现一个同义突变位点。结论冬凌草甲素通过激活Nrf2转录因子,减轻有害物质如酒精对小鼠肝脏造成的急性损伤;食管癌keap1的第四外显子中发现一个同义突变位点,未能发现错义突变,无法说明Nrf2/keap1通路的异常可能也存在于食管癌中,需要进一步证实。

关键词： Nrf2 keap1 冬凌草甲素食管癌

五甲基槲皮素对2型糖尿病大鼠海马keap1、γ-GCS表达的影响

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五甲基槲皮素对2型糖尿病大鼠海马KEAP1、γ-GCS表达的影响

作者：张红蕊华北理工大学

学位级别：硕士

目的本实验通过观察五甲基槲皮素(PMQ)对2型糖尿病大鼠海马区keap1、γGCS的表达水平影响,探讨PMQ改善糖尿病大鼠认知功能的可能机制。方法1分组13周龄GK雄性大鼠60只,适应性喂养2周后检测GK大鼠随机血糖均>11.1 mmol/L,符合成模标准。... 详细信息

目的本实验通过观察五甲基槲皮素(PMQ)对2型糖尿病大鼠海马区keap1、γGCS的表达水平影响,探讨PMQ改善糖尿病大鼠认知功能的可能机制。方法1分组13周龄GK雄性大鼠60只,适应性喂养2周后检测GK大鼠随机血糖均>11.1 mmol/L,符合成模标准。随机分为糖尿病模型组、PMQ高中低剂量组、α-硫辛酸组,每组各10只。Wister雄性大鼠10只,为正常对照组。2药物干预PMQ高、中、低剂量组(DMSO溶解)分别每日予2.5、5、10 mg/kg灌胃1次。正常对照组、糖尿病模型组均予每日灌胃一次等体积DMSO溶液。α-硫辛酸组每日予α-硫辛酸60mg/kg灌胃一次。共给药8周。3观察大鼠一般情况分别于给药前、给药后8周检测空腹血糖,给药后8周测糖化血红蛋白。4 Morris水迷宫实验药物干预8周后时进行水迷宫行为学实验。5制备标本及检测指标断头取材,快速完整分离海马组织,冻存。取海马组织,做HE染色、免疫组化等形态学实验,用Western Blot方法检测各组keap1、γ-GCS蛋白表达。结果1大鼠的一般情况及检测指标正常对照组精神状态良好,毛发光泽,活动自如。糖尿病模型组精神状态差,毛发杂乱、无光泽,行动比较迟缓,死亡两只。PMQ各剂量药物组及α-硫辛酸组大鼠较糖尿病模型组均不同程度改善。2大鼠血糖及糖化血红蛋白检测给药前:与正常组相比,糖尿病模型组大鼠血糖水平上升(P1)。给药8周后:与正常组相比,糖尿病模型组大鼠血糖水平上升(P1),糖化血红蛋白指标升高(P1);与糖尿病模型组相比,PMQ低、中剂量药物组血糖指标有所下降(P1);PMQ高剂量组血糖、糖化血红蛋白水平与α-硫辛酸组两组比较无统计学差异。3 Morris水迷宫实验结果定位航行实验结果:与正常对照组相比,糖尿病模型组的逃避潜伏期明显延长(P1),提示糖尿病大鼠学习记忆能力显著下降。与糖尿病模型组比较,PMQ中、低剂量组大鼠的潜逃潜伏期缩短(P1)。PMQ高剂量组、α-硫辛酸组组间比较无统计学差异。空间探索实验结果:与正常对照组相比,糖尿病模型组大鼠在目标象限停留的时间显著缩短(P1)。与糖尿病模型组相比,PMQ低、中剂量组大鼠在目标象限停留时间均延长(P1)。PMQ高剂量组、α-硫辛酸组两组间比较无明显差异。4 HE染色结果正常对照组海马CA1区神经细胞排列整齐,胞浆及细胞核饱满、清晰可见,形态正常,结构完整。糖尿病模型组海马CA1区的神经细胞排列紊乱、松散,胞体缩小,出现核固缩,染色质聚集,胞浆减少。与糖尿病模型组相比,药物干预组以及α-硫辛酸组细胞均不同程度改善,排列较整齐,结构较完整,以PMQ高剂量组和α-硫辛酸组改善效果最好。5免疫组化检测结果光镜下可见在阳性细胞的胞浆中出现棕黄色颗粒,各组均有阳性表达的细胞,在正常对照组有少量表达。与正常对照组比较,糖尿病模型组海马CA1区γGCS和keap1的阳性表达明显增加(P1)。与糖尿病模型组相比,PMQ低、中剂量组海马γ-GCS、keap1的阳性表达增多(Pkeap1阳性表达量显著提高(P1)。PMQ高剂量组、α-硫辛酸组两组间比较无明显差异。6 Western Blot检测结果正常对照组海马CA1区γ-GCS、keap1有低水平表达。糖尿病模型组海马CA1区γ-GCS、keap1表达水平较正常对照组明显增加(P1)。与糖尿病模型组比较,PMQ低、中剂量组海马CA1区γ-GCS、keap1表达升高(P1区γ-GCS、keap1明显上升(P1)。PMQ高剂量组、α-硫辛酸组两组间比较无明显差异。结论1 PMQ可以改善糖尿病大鼠认知功能障碍;2 PMQ可以提高糖尿病大鼠海马γ-GCS、keap1表达水平。

关键词： 2型糖尿病五甲基槲皮素 γ-GCS keap1 认知