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以菌株Pseudomonas putida kt2440为宿主构建多功能农药降解菌

应用与环境生物学报 2016年第6期22卷 1145-1149页

作者：易忠权王睿周潮洋陈雪婷洪青何健闫新李顺鹏南京农业大学生命科学学院南京210095 东南大学医学院附属盐城医院中心实验室盐城224000

通过富集培养法分离到的农药降解菌株存在稳定性差、底物谱窄、安全性不明等问题.Pseudomonas putida kt2440分离自根际土壤,是国际上公认的环境安全型菌株.利用同源重组方法将4种农药降解酶基因pytH、mpd、chd和amy A同时整合到*** kt2... 详细信息

通过富集培养法分离到的农药降解菌株存在稳定性差、底物谱窄、安全性不明等问题.Pseudomonas putida kt2440分离自根际土壤,是国际上公认的环境安全型菌株.利用同源重组方法将4种农药降解酶基因pytH、mpd、chd和amy A同时整合到*** kt2440的染色体上,获得了一株无抗性基因残留的工程菌*** kt-pmca.工程菌ktpmca能够同时降解拟除虫菊酯类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、百菌清和氯代酰胺类4种农药,百菌清降解率大于95%,甲氰菊酯、毒死蜱和敌稗的降解率均达到80%以上.此外,传代实验证明4种降解酶基因能够在遗传中稳定存在.本研究表明工程菌kt-pmca可为微生物原位修复消除农药污染提供新的菌株资源.

关键词：同源重组农药微生物降解 Pseudomonas putida kt2440 基因工程菌

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多功能降解菌Pseudomonas putida kt2440-DOP的构建与降解特性研究

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微生物学报 2006年第5期46卷 763-766页

作者：顾立锋何健黄星贾开志李顺鹏南京农业大学生命科学学院微生物学系农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

三唑磷水解酶基因为研究发现的一个新的广谱有机磷水解酶基因,通过PCR从有机磷降解菌株***-4总DNA扩增了tpd,将tpd定向克隆到pBBRMCS-5载体上,构建重组质粒pTPD,在辅助质粒pRK2013的帮助下,通过三亲接合将pTPD转移到模式菌株Pseudomonas... 详细信息

三唑磷水解酶基因为研究发现的一个新的广谱有机磷水解酶基因,通过PCR从有机磷降解菌株***-4总DNA扩增了tpd,将tpd定向克隆到pBBRMCS-5载体上,构建重组质粒pTPD,在辅助质粒pRK2013的帮助下,通过三亲接合将pTPD转移到模式菌株Pseudomonas putidakt2440中,获得的工程菌Pseudomonasputidakt2440-DOP可以降解多种有机磷农药及芳香烃化合物;kt2440-DOP的有机磷水解酶活较出发菌株MP-4提高了一倍左右,且遗传性状稳定。

关键词：有机磷农药 tpd kt2440 工程菌构建

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重组工程法敲除恶臭假单胞菌kt2440和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032染色体基因

重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032染...

引用

作者：骆希南京师范大学

学位级别：硕士

重组工程(Red/ET, recombination mediated genetic engineering)是指通过重组酶催化DNA分子之间的同源重组而实现DNA克隆和DNA修饰一种基因工程手段,是一种新型高效的遗传工程技术。其中的重组酶主要是λ噬菌体中redαβ基因表达的蛋白... 详细信息

重组工程(Red/ET, recombination mediated genetic engineering)是指通过重组酶催化DNA分子之间的同源重组而实现DNA克隆和DNA修饰一种基因工程手段,是一种新型高效的遗传工程技术。其中的重组酶主要是λ噬菌体中redαβ基因表达的蛋白和Rec前噬菌体中的recET表达的蛋白。利用重组工程从理论上可以完成对多种细菌及真菌中染色体DNA的敲除及修饰,而且通过重组工程可以避免其他基因敲除方法中要构建克隆的步骤,直接进行OE-PCR (Overlap extension PCR,重叠延伸PCR)即可获得重组片段。此种方法最先在大肠杆菌中实现,现在经过完善已逐渐在其他细菌及真菌中实施。本课题中的恶臭假单胞菌kt2440 (Pseudomonas putida kt2440)是在生物降解及异源表达中有重要作用的环境微生物,谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)是在工业中发酵生产各种氨基酸的菌株。随着这两种菌株全基因组测序的完成,对其基因功能的研究越来越深入。基因敲除是研究基因与蛋白质关系的重要手段,通过重组工程介导的基因敲除可以实现两种菌的高效基因敲除。本文介绍了不同系统的重组工程方法分别对P. putida kt2440和C. glutamicum ATCC 13032进行染色体基因敲除。对P. putida kt2440进行基因敲除中共涉及了一种双质粒系统和三种单质粒系统,只有双质粒Cre/loxP系统和一种由丙酮诱导的Cre/loxP单质粒系统完成了四种基因的无标记敲除。具体方法是制备含有能够表达相关重组酶基因的质粒的P. putida kt2440电转感受态细胞,将通过OE-PCR获得的重组片段转入到电转感受态细胞中,涂布于含有卡那霉素抗性的平板上进行筛选,在双质粒系统中,验证正确后,制备电转感受态细胞,转入含有cre基因的质粒,进行抗性基因的敲除,在此系统中目的基因的无痕敲除效率最高可以达到100%;在单质粒系统中,第一步的同源重组效率只能达到双质粒系统的1/5,推测可能与Cre酶的高本底水平表达有关,得到卡那霉素抗性菌株后直接接入含有丙酮的培养基中进行诱导培养一代即可消除抗性基因,虽然敲除效率达不到双质粒系统的效率,但是操作更加方便简洁且适合于高通量操作。对C. glutamicum ATCC 13032进行基因敲除中,本研究构建了redαβ和recET两种重组酶表达载体,其上包含有同源重组所需的各种重组酶基因,以及双链断裂修复过程中需要的I-Scel基因,具体方法是制备含有能够表达相关重组酶基因质粒的C. glutamicum ATCC 13032电转重组感受态细胞,将通过OE-PCR获得的重组片段转入重组感受态细胞中,涂布于含有卡那霉素的抗性平板上进行筛选,通过PCR进行验证,获得含有卡那霉素抗性基因的重组目的菌株。随后进行I-SceI介导的双链断裂修复系统进行第二次同源重组消除抗性基因。本研究用redaαβ.系统完成了crt12和upp两种基因的敲除,用recET系统完成了crtI2、upp和cgp3三种基因的敲除以及fasR基因中丝氨酸(AGT)到天冬酰胺(AAT)的点突变实验。但结果尝试了多种方法仍未实现I-SceI介导的抗性基因敲除,进一步的实验还在进行中。

关键词：重组工程基因敲除 Cre/loxP系统恶臭假单胞菌 kt2440 谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032

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