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1株柯萨奇病毒A组10型毒株在kmb17细胞上的遗传稳定性分析

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中国生物制品学杂志 2022年第7期35卷 813-817页

作者：许丹菡张捷丛山日张名冯昌增黄小琴孙浩杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析柯萨奇病毒A组10型毒株在人胚肺二倍体细胞(kmb17)上增殖的遗传稳定性。方法将V6-19/XY/CHN/2017毒株适应于kmb17细胞,并连续传代培养至15代。分别提取适应前及适应后第5、10、15代病毒RNA,分段对全基因组序列进行RT-PCR扩增、... 详细信息

目的分析柯萨奇病毒A组10型毒株在人胚肺二倍体细胞(kmb17)上增殖的遗传稳定性。方法将V6-19/XY/CHN/2017毒株适应于kmb17细胞,并连续传代培养至15代。分别提取适应前及适应后第5、10、15代病毒RNA,分段对全基因组序列进行RT-PCR扩增、测序及拼接,利用Maga 7.0、Geneious 6.1.4等软件进行系统进化及同源性分析。结果命名该kmb17细胞适应株为K6-19/XY/CHN/2017,各子代病毒感染性滴度为7.25~7.75 lgCCID_(50)/mL。适应前后4个子代病毒的全基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.99%~100%和99.95%~100%。适应前与适应后第5、10代毒株均无核苷酸和氨基酸序列突变,第15代毒株VP4区域发生1个核苷酸突变(VP4172 A→G)及1个氨基酸突变(VP458 Ile→Val)。结论CV-A10能较好地适应kmb17细胞,K6-19/XY/CHN/2017在kmb17细胞上适应后可保持较高的病毒滴度和遗传稳定性,为后续疫苗研发奠定了实验基础。

关键词：柯萨奇病毒A组10型 kmb17细胞分子特征遗传稳定性

轮状病毒在kmb17细胞上的适应性培养及免疫原性研究

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轮状病毒在KMB17细胞上的适应性培养及免疫原性研究

作者：马应霞昆明医学院

学位级别：硕士

轮状病毒(rotavirus, RV)是引起世界范围内婴幼儿急性腹泻最主要的病原之一,也是造成发展中国家婴幼儿死亡的重要原因,占所有肠道感染病因的50%以上¨。按照内层衣壳蛋白VP-6的组特异性抗原表位不同,可将RV分为A-G7个组,其中A组RV是引... 详细信息

轮状病毒(rotavirus, RV)是引起世界范围内婴幼儿急性腹泻最主要的病原之一,也是造成发展中国家婴幼儿死亡的重要原因,占所有肠道感染病因的50%以上¨。按照内层衣壳蛋白VP-6的组特异性抗原表位不同,可将RV分为A-G7个组,其中A组RV是引起婴幼儿重症腹泻的主要原因。目前尚无治疗RV腹泻的特效药物,口服补液(ORS)治疗的效果也是有限的,特别对重症患儿并不能明显降低其死亡率。因此,世界卫生组织(WHO)认为,研发优质高效安全的RV疫苗是预防、控制RV感染唯一有效的手段。对于任何一种疫苗而言,其安全性和有效性都是疫苗本身最重要的基本要素,在研制疫苗时最大限度地考虑安全性非常重要。影响疫苗安全性的因素很多,其中用于制备疫苗的细胞基质是重要影响因素之一。一般而言,人源性细胞较其他动物源性细胞其安全性要高,但限于多方面的原因,许多疫苗尚不能用人源性细胞制备;但使用人源性细胞取代非人源性细胞制备疫苗是发展方向。轮状病毒疫苗在预防RV感染中发挥了重要作用,但目前国内外RV疫苗主要是在动物源性细胞制备的,用一种人源性细胞来制备RV疫苗是一值得研究的课题。本研究基于这一思路开展了相关探索,我们分别将在Vero细胞上培养的猴轮状病毒P[2]G3株(SA11株)和人轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在kmb17细胞(一株用于人用疫苗生产的细胞株)上进行适应培养,各连续传代10代。结果显示,轮状病毒SA11株和Wa株经在kmb17细胞上适应培养后,随着传代代次的增高,细胞病变逐渐增快,病毒感染性滴度呈递增趋势,并稳定在较高水平。用荧光灶法测得SA1l株病毒滴度峰值达到7.751gCCID50／ml,Wa株病毒滴度峰值达到7.331gCCID50／ml。在连续传代的过程中,确定了病毒接种的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.05。电镜下观察可见典型的轮状病毒颗粒;免疫荧光证实了病毒能在kmb17细胞内复制增殖;且两株适应于kmb17细胞的病毒均可在MA104细胞中形成蚀斑。通过RT-PCR分别扩增两株病毒第1代和第10代的VP7基因测序表明,SA11株病毒VP7基因在传代过程中基因序列未发生改变,保持了良好的遗传稳定性;Wa株病毒VP7基因在传代过程中仅发生了一处基因突变,且为无义突变。用在kmb17细胞上适应培养的RV病毒免疫小鼠,经皮下注射和口服两种免疫途径均获得了针对病毒的特异性抗体,其中SA11株经皮下注射获得的抗体滴度达20480±8192,明显高于经口服免疫的抗体滴度(10240±4096),经t检验,P0.05,无显著差异。本研究成功地将两个血清型的轮状病毒SAll株和Wa株适应至kmb17细胞,并获得了较高感染性滴度的子代病毒,用复制的病毒免疫小鼠,经证实具有较好的免疫原性,为日后轮状病毒的大规模制备以及研制一种对人体更为安全的轮状病毒疫苗奠定了重要的基础。

关键词：轮状病毒 kmb17细胞适应性遗传稳定性免疫原性

一株柯萨奇病毒A组6型毒株RYN-A1205的分子特征及其在kmb17细胞上的遗传稳定性研究

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中国病毒病杂志 2020年第2期10卷 102-108页

作者：刘红波张捷许丹菡丛山日黄小琴孙浩杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的研究1株手足口病相关柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CV-A6)毒株RYN-A1205的分子特征及其在kmb17细胞中连续传代的遗传稳定性。方法利用MEGA7.0软件并采用neighborjoining法对RYN-A1205株及65株CV-A6代表株基于全长VP1序列进... 详细信息

目的研究1株手足口病相关柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CV-A6)毒株RYN-A1205的分子特征及其在kmb17细胞中连续传代的遗传稳定性。方法利用MEGA7.0软件并采用neighborjoining法对RYN-A1205株及65株CV-A6代表株基于全长VP1序列进行种系进化分析。另外,将RYNA1205株以MOI=1接种至kmb17细胞中于37℃连续传代培养,提取适应前及适应后第1、5、10、15代毒株的RNA,以其为模板,RT-PCR分段扩增全基因组序列并进行测序分析。结果RYN-A1205株属于D3基因亚型中的D3a分支,能较好地适应kmb17细胞。与适应前毒株相比,适应后毒株共发生15个碱基突变,造成12个氨基酸替换。适应后各代次病毒全基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.97%~100%和99.90%~100%,其中,P10代在VP2和3D编码区各发生1个氨基酸的替换,P15代氨基酸突变情况与P10代一致。结论RYN-A1205株与我国近几年的CV-A6内地流行株在进化树中属于同一分支,在kmb17细胞上适应后保持良好的遗传稳定性,这为后续CV-A6疫苗的研发提供参考。

关键词：柯萨奇病毒A组6型分子特征 kmb17细胞遗传稳定性

kmb_(17)细胞培养流感病毒的实验研究

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云南大学学报（自然科学版） 2007年第5期29卷 536-540页

作者：王海漩杨怀德陈俊英魏晓露廖国阳李卫东中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 昆明医学院云南昆明650031

探讨了流感病毒在kmb17细胞上培养的可行性.将3株不同型别的流感病毒(A/Wisconsin/67/2005H3N2,A/New Caledonia/20/1999 H1N1和B/Malaysia/2506/2004)分别接种于kmb17细胞上,在无血清的条件下于不同pH值和不同胰酶浓度的维持液中35℃培养72 h后收获病毒,测定血凝效价.实验结果表明,所用的3个毒株中的H3N2亚型毒株(A/Wisconsin/67/2005 H3N2)血凝效价明显高于另外的H1N1亚型(A/NewCaledonia/20/1999 H1N1)和B型(B/Malaysia/2506/2004)毒株.因此认为kmb17细胞可作为培养流感病毒的备选培养基质.

关键词：流感病毒 kmb17细胞血凝效价

重组人成纤维细胞生长因子21慢病毒质粒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2015年第7期28卷 677-681页

作者：陈瑜徐丽兰杨建波马开利和占龙马进李鸿钧吴正存鲁帅尧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,h FGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro,构建重组慢病毒质粒... 详细信息

目的构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,h FGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro,构建重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21,经293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,并感染kmb17靶细胞。荧光显微镜观察293T细胞中报告基因EGFP的绿色荧光,判断重组慢病毒的感染效率;RT-PCR法检测kmb17靶细胞中h FGF21基因m RNA的转录;免疫荧光和Western blot法检测kmb17靶细胞中h FGF21蛋白的表达。结果重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21经双酶切及测序鉴定,证明构建正确,在包装细胞中获得较高的转染效率,重组慢病毒感染kmb17靶细胞72 h后,荧光显微镜下可见EGFP绿色荧光。感染组kmb17靶细胞中存在h FGF21基因m RNA的转录和蛋白的表达。结论成功构建了重组慢病毒质粒PLV-EF1aEGFP[2A]Puro-h FGF21,并于kmb17靶细胞中表达,为FGF21功能与特性的相关研究及基因工程药物的探索和研发奠定了基础。

关键词：人成纤维细胞生长因子21 慢病毒质粒 kmb17细胞

不同细胞对柯萨奇病毒A组10型毒株的敏感性及滴度检测影响因素分析

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中国病毒病杂志 2020年第4期10卷 267-271页

作者：高微捷岳磊杨婷宋霞李华谢天宏何鑫卫星辰谢忠平中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的探讨不同细胞对柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株的敏感性和滴度检测影响因素,为临床样品分离、病毒培养及保存使用提供基础数据。方法10株已在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞分离并培养2代的C... 详细信息

目的探讨不同细胞对柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株的敏感性和滴度检测影响因素,为临床样品分离、病毒培养及保存使用提供基础数据。方法10株已在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞分离并培养2代的CV-A10毒株,检测其在Vero细胞、人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell,kmb17)、人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞及人喉癌细胞(human laryngeal carcinoma cell,HeP-2)上的感染性滴度,并对毒株进行蚀斑纯化和冻融处理。结果CV-A10毒株均能适应Vero细胞、kmb17细胞及RD细胞,不能适应HeP-2细胞。RD细胞上第1天即开始病变,第4天达到增值高峰,感染性滴度最高,达到7.75 lgCCID50/ml;kmb17细胞上病变最慢,第3天发生病变,第5天达到增值高峰,滴度为4.85 lgCCID50/ml。毒株在37℃放置3 d感染性滴度明显下降,4℃放置3 d,-30℃和-80℃放置30 d感染性滴度均无影响。结论RD细胞是CV-A10毒株最敏感的细胞,HeP-2细胞不敏感。CV-A10毒株反复冻融次数不宜超过5次,保存温度越低越好并避免4℃和常温下长时间放置。

关键词：柯萨奇病毒A组10型感染性滴度生长特性细胞敏感性 Vero细胞 RD细胞 kmb17细胞