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塔里木裂腹鱼kiss1和kiss2基因的克隆、组织表达及kiss1繁殖性状相关SNP位点筛选

塔里木裂腹鱼KISS1和KISS2基因的克隆、组织表达及KISS1繁殖性状...

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作者：赵年桦塔里木大学

学位级别：硕士

塔里木裂腹鱼(Schizothorax biddulphi)是仅分布于新疆南疆的特有鱼类,由于过度捕捞、水利设施等因素再加上自身条件的限制,资源恢复相当困难。对于生长缓慢、繁殖成熟晚、自然种群补充不足的濒危鱼类而言,实现大规模人工繁殖和养殖是... 详细信息

塔里木裂腹鱼(Schizothorax biddulphi)是仅分布于新疆南疆的特有鱼类,由于过度捕捞、水利设施等因素再加上自身条件的限制,资源恢复相当困难。对于生长缓慢、繁殖成熟晚、自然种群补充不足的濒危鱼类而言,实现大规模人工繁殖和养殖是资源恢复的重要途径之一,因此掌握该鱼的生殖调控方法迫在眉睫。kiss基因是生殖调节级联相关的关键调控因子,因此,鉴定和分析kiss基因的作用对进一步阐明塔里木裂腹鱼的繁殖机制具有重要意义。本实验以塔里木裂腹鱼作为研究对象,利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)获得了塔里木裂腹鱼两种kiss基因(kiss1和kiss2)的全长c DNA序列;采用q RT-PCR技术检测了kiss1和kiss2基因在心、肝脏、中肾、肌肉、性腺、眼、下丘脑、垂体、鳃、鳍和鳔的分布特征;利用直接测序法检测出塔里木裂腹鱼kiss1基因的多态性,并筛选出繁殖性状有利的基因型,为了解kiss基因在塔里木裂腹鱼生殖中的作用提供理论基础,也为该鱼种的资源保护与恢复、优势品种的培育奠定分子基础。主要研究结果如下:1.塔里木裂腹鱼kiss1和kiss2基因的克隆与分子特征塔里木裂腹鱼kiss1基因序列全长为658bp,ORF全长327bp,编码108个氨基酸,5′UTR为62bp,3′UTR为269bp,kiss1蛋白理论等电点为9.34,分子量大小为12.45k D,其编码的108个氨基酸中,包含19种氨基酸,蛋白原子总数为1733个,且归属为不稳定性蛋白质,其二级结构主要包含α-螺旋、延伸链及无规则卷曲3种二级元件,信号肽位于第15和16号氨基酸之间,不存在跨膜结构域,其丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点分别有10、8、7个,亚细胞主要定位于细胞外,推测其功能的发挥主要在细胞外。同源性结果分析表示,kiss1基因保守性较高,且与理氏裂腹鱼的亲缘关系最近,为98.04%,与其他生物的同源性在80.56%～94.74%之间。kiss2基因序列全长为582bp,ORF为378bp,编码125AA,5′UTR为12bp,3′UTR为192bp,kiss2蛋白理论等电点为8.93,分子量大小为14.60k D,125个氨基酸中包含18种氨基酸,蛋白原子总数为2028个,不稳定性指数为69.76,归类为不稳定性蛋白。其二级结构包含无规则卷曲、α-螺旋和延伸链3种类型,分别占56.00%、35.20%和8.80%,信号肽位于第19和20号氨基酸之间,不属于跨膜蛋白,其苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸磷酸化位点分别有8、15、4个,亚细胞主要定位于细胞核,推测其功能的发挥主要在细胞核。同源性结果分析表示,kiss2基因保守性较高。2.塔里木裂腹鱼kiss1和kiss2基因在不同组织中的表达量利用q RT-PCR技术检测出kiss1基因在塔里木裂腹鱼的心脏、肝脏、中肾、肌肉、性腺、眼、下丘脑、垂体、鳃、鳍和鳔组织中均存在表达,表达量最高的组织为性腺,次高表达量为肌肉,随后从高到低为鳔、垂体、心、下丘脑、鳃、鳍、肝、眼和中肾;kiss2基因也在11种组织中均有表达,在性腺中表达量最高,肌肉的表达量次之,随后从高到低为垂体、鳃、心、鳔、下丘脑、鳍、肝、中肾和眼。说明kiss1和kiss2基因参与塔里木裂腹鱼的生殖过程,也暗示该基因存在其他方面的生理功能。3.塔里木裂腹鱼雄鱼kiss1基因繁殖性状相关联的SNPs位点的筛选kiss1基因外显子区域检测到3个SNPs位点,三个位点在塔里木裂腹鱼群体中偏离Hardy-Weinberg平衡(PT位点显著影响塔里木裂腹鱼的性腺质量和成熟系数,其中在SNP c.3G>T处,TT基因型个体的性腺质量和成熟系数显著高于GG基因型的个体(P0.05)。因此,在塔里木裂腹鱼繁殖性能提升中可针对SNP c.3G>T位点信息对个体进行选配。

关键词：塔里木裂腹鱼 kiss1基因 kiss2基因基因克隆基因表达模式单核苷酸多态性

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