检索结果-南通市图书馆

检索条件"主题词=KCND3基因"

共 2 条记录，以下是1-10 订阅

全选清除本页清除全部题录导出标记到"检索档案"

详细简洁

排序：

脊髓小脑共济失调19型kcnd3基因突变分析及致病机制研究

脊髓小脑共济失调19型KCND3基因突变分析及致病机制研究

引用

作者：刘分郑州大学

学位级别：硕士

背景遗传性脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia,SCAs)是一组常染色体显性遗传性神经退行性疾病,患者在各个年龄阶段均可发病,病变主要累及小脑、脑干和脊髓。临床表现复杂多样,其特征是缓慢进展的小脑共济失调。目前发现有30余种... 详细信息

背景遗传性脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia,SCAs)是一组常染色体显性遗传性神经退行性疾病,患者在各个年龄阶段均可发病,病变主要累及小脑、脑干和脊髓。临床表现复杂多样,其特征是缓慢进展的小脑共济失调。目前发现有30余种SCA亚型,国内常见亚型有SCA1-3、SCA6-7、SCA12、SCA17等。前期工作中,我们建立了共济失调临床数据库,在排除了上述国内SCA常见亚型以及齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy,DRPLA)的基础上。对115例共济失调家系病例和67例散发性共济失调病例,我们进一步行kcnd3基因突变的筛查及对筛查到突变位点进行致病机制研究。目的筛查kcnd3基因突变及应用患者特异IPS来源神经元模型探讨kcnd3基因突变导致脊髓小脑共济失调19的致病机制研究。方法1、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)结合Sanger测序技术对182例诊断为共济失调的患者(家系115例,散发67例)和200例性别比例和年龄相仿的健康志愿者行kcnd3基因突变筛查,并对筛查到的突变位点行致病性预测分析。2、运用体细胞重编程技术构建患者和健康志愿者体细胞来源的诱导多能干细胞(induce pluripotent stem cell,iPS),并将其分化为神经前体细胞、神经元。3、提取健康志愿者和SCA19患者第30天神经元RNA进行转录组测序,运用OmicShare tools分析差异表达基因及运用DAVID在线分析软件对差异基因进行基因功能注释和生物信息学富集分析,同时应用RT-PCR、Western blot对健康志愿者和SCA19患者神经元转录组中差异表达基因的mRNA及相关蛋白进行验证。结果1、PCR结合Sanger测序技术,在纳入对象中筛查出1例kcnd3基因第3个外显子第1130位碱基胞嘧啶(C)变成了胸腺嘧啶(T),即:c.1130C>T,结果导致这个基因编码的蛋白第377位氨基酸由极性苏氨酸变成了非极性蛋氨酸,即:p.T377M,经生物信息分析,该单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphisms,SNP)位点有相对较强的致病性。2、成功构建健康志愿者和患者体细胞来源的诱导多能干细胞系,并成功将其分化为神经前体细胞、神经元。3、在SCA19患者和健康志愿者的神经元转录组中共鉴定出1.5万个基因,其中有1958个基因在健康志愿者和SCA19患者来源神经元中表达差异有统计学意义(P基因929个,上调基因1029个,kcnd3基因在健康志愿者和SCA19患者来源神经元中表达无差异。GO富集分析示差异基因主要与分子功能(Molecular Function,MF)、生物过程(Biological Process,BP)和细胞组成(Cellular Component,CC)相关。KEGG通路分析结果示差异基因明显富集于粘附斑激酶(focal adhesion Kinase)信号通路和内质网蛋白质加工(protein processing in endoplasmic reticulum)信号通路。另外在差异表达基因中发现基于内质网应激的PERK-ATF4-CHOP信号通路相关指标ATF4、CHOP的mRNA表达量增加,进一步的RT-PCR、Western blot的检测结果显示ATF4、CHOP的mRNA及蛋白表达量均增加,这与转录组测序数据一致。讨论1、首次在中国汉族人群中发现kcnd3基因第3个外显子第1130处发生c.1130C>T错义突变,该SNP位点有相对较强的致病性。2、kcnd3基因c.1130C>T错义突变可导致患者仅出现轻微的纯小脑共济失调和头部震颤,扩展了kcnd3基因错义突变所导致SCA19的临床新表型。3、成功在体外构建患者和健康志愿者来源神经元,为体外研究SCA19发病机制提供了良好的细胞疾病模型。4、转录组测序结果示kcnd3基因在健康志愿者和SCA19患者来源神经元中表达无差异,RT-PCR检测kcnd3基因mRNA在健康志愿者和SCA19患者中表达也无差异,而Western blot结果却显示与正常相比Kv4.3突变型蛋白表达量减少,这可能是kcnd3错义突变引起Kv4.3突变型蛋白的错误折叠,从而通过泛素化降解,可能是导致Kv4.3突变型蛋白表达量减少的原因。另外,我们在差异表达基因中发现基于内质网应激的PERK-ATF4-CHOP信号通路中相关指标ATF4、CHOP的mRNA表达量增加,进一步的RT-PCR、Western blot的检测结果示ATF4、CHOP的mRNA及蛋白表达量均增加,这与转录组测序数据一致,因此分析kcnd3基因c.1130C>T错义突变可能导致自身蛋白折叠错误滞留在内质网,从而

关键词： kcnd3基因遗传性脊髓小脑共济失调19 神经元转录组测序

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

慢性心房颤动患者心房肌KChIP2基因mRNA水平的定量检测和表达质粒pEGFP-KChIP2的构建

慢性心房颤动患者心房肌KChIP2基因mRNA水平的定量检测和表达质粒...

引用

作者：谭晓秋泸州医学院

学位级别：硕士

目的:心房颤动(Atrial Fibrillation,AF)简称房颤,是最为常见的快速性心律失常之一,其患病率随着年龄的增长而增加,容易引起心房内血栓、脑栓塞等严重并发症,有很高的死亡率[1-3]。业已证明,房颤时,心肌细胞钾通道、钙通道等发生明显改... 详细信息

目的:心房颤动(Atrial Fibrillation,AF)简称房颤,是最为常见的快速性心律失常之一,其患病率随着年龄的增长而增加,容易引起心房内血栓、脑栓塞等严重并发症,有很高的死亡率[1-3]。业已证明,房颤时,心肌细胞钾通道、钙通道等发生明显改变,其电流水平和相应的编码基因和蛋白水平存在明显的上调或下调[4-8]。人心肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)主要由Kv4.3(kcnd3)基因编码,是心肌复极化的重要离子流,决定动作电位的早期复极并且影响其它复极化离子流[9]。KChIP2(Kv channel interacting protein 2, KChIP2)是心肌细胞瞬时外向钾通道的重要调控亚单位,参与调控通道基因表达和电流特性,在Ito发挥正常功能中起着不可或缺的作用[10, 11]。本课题采用实时荧光定量PCR技术通过对房颤时KChIP2和kcnd3基因mRNA水平进行定量研究,探讨KChIP2在房颤中的作用和对于瞬时外向钾通道的可能调控机制。方法:①30例接受体外循环手术的风湿性心脏病(rheumatic heart disease,RHD)患者分为两组:窦性心律组(SR组)13例、房颤心律组(AF组)17例,取其常规切除的右心耳组织作为研究对象;②提取心房肌组织总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和TA克隆技术构建含有目的基因片段的质粒标准品和标准曲线;③以GAPDH为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测慢性心房颤动和窦性心律患者KChIP2和kcnd3基因mRNA水平;结果:①总RNA质量:提取的总RNA通过紫外分光光度仪测量,A260/A280在1.80-2.10之间,A260/A230在1.90-2.20之间,浓度大于300ng/μl,通过1%琼脂糖凝胶电泳得出,28S带和18S带明显,灰度比大于1,5S带不明显,无拖尾;②标准曲线和熔解曲线:标准曲线线性关系良好,相关系数R2>0.99,KChIP2基因的标准曲线为y=-0.23x+6.69(R2=0.994),kcnd3基因的标准曲线为y=-0.20x+6.24(R2=0.996),GAPDH基因的标准曲线为y=-0.23x+5.94(R2=0.998),熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致;③SR组和AF组KChIP2/GAPDH比值分别为0.2200±0.0388(n=13),0.1468±0.0452(n=17),AF组KChIP2基因mRNA水平低于SR组,Pkcnd3/GAPDH比值分别为0.5257±0.1427(n=13),0.3946±0.1826(n=17),AF组kcnd3基因mRNA水平低于SR组,P基因和kcnd3基因明显下调,KChIP2和kcnd3基因下调是房颤时Ito电流下调的分子基础。目的:瞬时外向钾电流(Ito)是人心肌复极化的主要离子流,决定动作电位的早期复极并影响其它复极化离子流。大量研究表明,瞬时外向钾电流在心房颤动[4,5,30]、心力衰竭和心肌肥大[15]等疾病中电流密度下调,其编码的基因和蛋白质水平都呈相应的下调。KChIPs作为瞬时外向钾通道最重要的辅助亚基,在调控通道基因表达和电流特性中起重要作用。KChIP2能够促进瞬时外向钾通道蛋白由内质网向细胞膜的运输和增加通道在细胞膜的表达,能够较大的增加Ito电流密度,减慢Ito失活,加快失活后恢复和增加Kv4通道mRNA水平,表明KChIP2在维持Ito的电生理学特性中扮演重要角色[10,11,23,24,31-33]。本实验拟采用RT-PCR和定向克隆技术,构建人心房肌KChIP2基因表达质粒pEGFP-KChIP2,为进一步研究KChIP2对瞬时外向钾通道的调控功能奠定基础。方法:①取接受体外循环手术常规切除的右心耳作为研究对象,提取总RNA,逆转录得到cDNA;②通过特异性引物进行PCR扩增得到KChIP2编码区全长序列,亚克隆到pMD18-T载体中,得到重组克隆质粒pMD18-T-KChIP2;③再设计带有酶切位点Hind III和BamH I的特异性引物,对重组克隆质粒pMD18-T-KChIP2进行PCR扩增,得到含有酶切位点的KChIP2编码区全长序列;④对含有酶切位点的KChIP2全长片段和pEGFP-c1进行Hind III和BamH I双酶切反应,然后进行电泳后胶回收,再进行连接反应;⑤连接之后转入感受态大肠杆菌中,过夜培养;⑥提取质粒,测序鉴定。结果:①KChIP2编码区全长扩增片段电泳结果与目的大小663bp位置一致;②质粒测序结果与PubMed数据库KChIP2(AY026328)序列比对,其中661bp完全匹配,其中第253位碱基由T→C,相应的氨基酸由苯丙氨酸(TTC)→亮氨酸(

关键词：心房颤动瞬时外向钾通道 KChIP2基因 kcnd3基因实时荧光定量PCR 心肌细胞钾通道相关蛋白2 基因克隆

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

全选清除本页清除全部题录导出标记到“检索档案”

共1页 << < 1 > >>

回到顶部

执行限定条件

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：