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发根农杆菌介导西瓜转基因过表达体系的建立

果树学报 2019年第12期36卷 1763-1770页

作者：王平勇徐永阳赵光伟贺玉花孔维虎张健刘水苗户克云侯冲王兰菊徐志红中国农业科学院郑州果树研究所郑州450009 河南农业大学园艺学院郑州450002

【目的】建立发根农杆菌介导的西瓜转基因不定根过表达体系。【方法】探索利用野生型发根农杆菌k599侵染西瓜材料‘Sugar Baby’,诱导西瓜产生不定根的实验方法。借助该方法,将含有GUS基因和EGFP基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA13... 详细信息

【目的】建立发根农杆菌介导的西瓜转基因不定根过表达体系。【方法】探索利用野生型发根农杆菌k599侵染西瓜材料‘Sugar Baby’,诱导西瓜产生不定根的实验方法。借助该方法,将含有GUS基因和EGFP基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌k599,侵染西瓜材料‘Sugar Baby’,通过常规PCR、qRTPCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测,评价该过表达体系的效果。【结果】利用野生型和导入外源质粒的发根农杆菌均能成功诱导西瓜‘Sugar Baby’产生不定根。PCR检测结果显示,携带pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper载体的发根农杆菌k599诱导产生的不定根阳性率达到100%。qRT-PCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测均能成功检测到GUS基因和EGFP基因的过量表达。【结论】利用发根农杆菌k599诱导西瓜产生不定根介导基因过表达的方法,具有周期短,操作方便,转化率高的特点,可实现基因功能的快速验证,为西瓜根系相关基因的功能研究提供技术支持。

关键词：西瓜发根农杆菌 k599 过表达

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发根农杆菌介导甜瓜转基因过表达体系的建立

中国瓜菜 2019年第12期32卷 15-18,30页

作者：王平勇徐永阳赵光伟贺玉花李明孔维虎张健刘水苗刘梦丽徐志红中国农业科学院郑州果树研究所

遗传转化是实现基因功能验证和基因快速转育的重要手段,但目前甜瓜的遗传转化依旧存在众多技术难题。笔者利用野生型发根农杆菌k599侵染甜瓜’E31’,成功诱导甜瓜产生了不定根。借助该技术,将含有GUS基因和EGF基因的过表达载体pCAMBIA3... 详细信息

遗传转化是实现基因功能验证和基因快速转育的重要手段,但目前甜瓜的遗传转化依旧存在众多技术难题。笔者利用野生型发根农杆菌k599侵染甜瓜’E31’,成功诱导甜瓜产生了不定根。借助该技术,将含有GUS基因和EGF基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌k599,利用转化后的农杆菌侵染甜瓜’E31’,成功诱导出了不定根。PCR检测结果表明,新生不定根的阳性率达到100%。通过GOS染色和激光共聚焦显微镜检测,在不定根中检测到GOS基因和EGFP基因的大量表达,成功实现了外源基因在甜瓜新生不定根内过表达。该方法周期短、操作方便、转化率高,可实现基因功能的快速验证,为甜瓜根系抗病抗逆方面的研究提供技术支持。

关键词：甜瓜发根农杆菌 k599 过表达

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黄瓜‘中国龙’毛状根诱导体系的建立

中国瓜菜 2016年第2期29卷 6-9,19页

作者：林志豪邓钰宏赵静华南农业大学农学院广州510642 广东生态工程职业学院广州510520

黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系，可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料，从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3... 详细信息

黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系，可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料，从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3方面，研究发根农杆菌菌株k599对‘中国龙’毛状根诱导的情况。结果表明，75％（φ）的乙醇先处理种子30s，再用5％的次氯酸钠灭菌5—10min的种子消毒方法，农杆菌菌液OD600值在1．2左右时进行侵染，共培养2天，是获得‘中国龙’毛状根的适宜组合方法。PCR扩增结果证实，经这样诱导出的黄瓜毛状根中，发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。试验探索出了一套适合‘中国龙’毛状根诱导的方法。

关键词：黄瓜 '中国龙’ 毛状根发根农杆菌 k599

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百合遗传转化与基因编辑体系探究

百合遗传转化与基因编辑体系探究

作者：刘灏上海师范大学

学位级别：硕士

百合（Lilium spp.）被誉为球根花卉之王,世界十大鲜切花之一,有极高的观赏价值和经济价值。尽管我国拥有丰富的百合野生资源,但目前商业化的切花百合种球超过80%都是依靠进口,主要的原因是我国百合育种工作与国外相比起步较晚、技术水... 详细信息

百合（Lilium spp.）被誉为球根花卉之王,世界十大鲜切花之一,有极高的观赏价值和经济价值。尽管我国拥有丰富的百合野生资源,但目前商业化的切花百合种球超过80%都是依靠进口,主要的原因是我国百合育种工作与国外相比起步较晚、技术水平还比较落后,自主培育的优良性状的百合品种非常少。因此,为了我国百合产业的健康稳定发展,发展高效的育种技术、利用我国丰富的百合资源创制优质的百合品种势在必行。近年来,基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术迅速发展,为花卉的育种工作提供了既简单又高效的新方法。然而百合的遗传转化十分困难,亟需建立稳定高效的遗传转化体系与基因编辑体系,创制百合新种质资源。本研究探索建立百合多策略的遗传转化体系及基因编辑系统,主要研究结果如下:1.百合基因编辑系统的建立。针对百合切花寿命、无花粉、重瓣花型等育种目标,构建了相关基因ACO、Lo MYB80、LLA23、AG1、AG2的基因敲除载体,构建了作为选择标记的PDS基因敲除载体。2.多策略百合遗传转化体系的优化。去除了侵染与共培养阶段MS中的kHPO、NHNO、kNO、Ca Cl以利于根癌农杆菌的侵染;在共培养培养基中添加10 m MLMES以稳定p H;探索了百合无菌苗茎段诱导的愈伤组织、花丝诱导的愈伤组织、无菌苗鳞片等不同受体材料进行的遗传转化;探索了EHA105、LBA4404等不同根癌农杆菌介导的百合遗传转化;探索了基因枪法介导的百合遗传转化;探索了生长调控因子GRF4-GIF1和WOX5对百合遗传转化的影响。***百合中遗传转化体系的建立。首次建立了根癌农杆菌AGL1介导的LA百合“布林迪西”的遗传转化体系,得到了带有RUBY甜菜碱红色的愈伤组织,转化效率为4.5%。4.百合切-浸-生芽（cut-dip-budding,CDB）遗传转化体系的建立。研究表明发根农杆菌k599可以在百合中实现遗传物质传递。在麝香百合“白色帝王”中得到了带有绿色荧光的毛状根,转化效率为1.1%;在LA百合“巴赫”中得到了带有绿色荧光的茎,转化效率为1.2%;在东方百合“西伯利亚”中得到了带有绿色荧光的毛状根,转化效率为3.8%。5.百合单倍体育种体系的探索。确定了最适用于百合的花药诱导培养基:MS+2.0 mg·LPIC+1 mg·LNAA+1 mg·LkT+50 g·LSucrose+3.5 g·LPhytagel,成功诱导出愈伤组织并分化成再生植株。综上所述,本文建立了根癌农杆菌AGL1与发根农杆菌k599介导的2种百合遗传转化体系,为后续百合基因编辑育种工作奠定了基础。

关键词：百合遗传转化基因编辑 AGL1 CDB递送系统 k599