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检测k-ras g12d点突变的灵敏、无酶、无标记电化学传感器的研究

检测K-ras G12D点突变的灵敏、无酶、无标记电化学传感器的研究

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作者：周晓梅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:k-ras基因是表皮生长因子受体(EgFR)信号通路中最常发生突变的基因,其中最常见的突变类型是k-ras g12d点突变(k-ras g12dM)。k-ras基因的突变状态被认为是结直肠癌患者早期诊断和靶向药物疗效评估的关键性指标。考虑到现有检测手... 详细信息

目的:k-ras基因是表皮生长因子受体(EgFR)信号通路中最常发生突变的基因,其中最常见的突变类型是k-ras g12d点突变(k-ras g12dM)。k-ras基因的突变状态被认为是结直肠癌患者早期诊断和靶向药物疗效评估的关键性指标。考虑到现有检测手段存在的一些缺陷,如灵敏度和特异性有限、操作程序复杂、仪器设备昂贵等,本研究拟构建一种灵敏、高效的电化学传感器用于低丰度突变标志物的检测,为相关疾病的诊疗提供了有力的工具。方法:1.金电极的表面修饰:将TCEP还原的捕获探针(H)修饰在电极表面,然后用封闭剂(MCH)覆盖电极表面的非特异性位点。2.液相循环扩增体系的建立:首先,将反应链(S,S)与靶dNA混合,形成完整的dNAzyme活性结构。随后,将dNAzyme酶切底物链(H)与杂交反应链(H,H)依次加入上述混合液中进行扩增反应。dNAzyme酶切这一循环过程被琼脂糖凝胶电泳验证。3.电化学传感器的构建及信号检测:将液相扩增体系转移到修饰的金电极表面激活杂交链反应,电活性指示剂亚甲蓝(MB)插入杂交双链而产生电化学信号。传感器的构建过程通过电化学阻抗法(EIS)和循环伏安法(CV)进行验证。优化实验条件后,利用差分脉冲伏安法(dPV)对不同浓度的k-ras g12dM进行电化学检测并绘制标准曲线。4.传感器性能评估:包括灵敏度、特异性、稳定性及回收率实验。结果:1.dNAzyme的循环酶切过程通过琼脂糖凝胶电泳得到了验证。2.电化学阻抗法和循环伏安法验证了传感器的逐层组装过程,表明电化学传感器成功构建。3.在固定最优的实验参数后,电化学信号与靶dNA浓度的对数值呈线性相关,检测范围是0.5 fM-50 nM,线性方程为I(μA)=2.75928lg c(pM)+14.2228(R=0.99348)。4.该传感器性能良好,检测限低至0.5 fM,具有较好的特异性和重复性,回收率结果也比较满意。结论:通过整合dNAzyme和HCR两种信号放大机制,成功构建了一种灵敏高效的电化学传感策略用于低浓度k-ras g12d点突变的检测,且重复性、特异性及回收率结果都令人满意。此外,该传感策略无需蛋白酶、无需标记,成本低廉,具有较高的临床应用潜力。

关键词：电化学传感器双重级联放大无酶无标记检测 k-ras g12d点突变

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