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水稻白叶枯菌jxov中tal17.5基因的克隆与功能研究

水稻白叶枯菌JXOV中tal17.5基因的克隆与功能研究

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作者：孙荣华南京农业大学

学位级别：硕士

水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)是目前水稻上最为严重的病害之一,给水稻的生产造成了严重损失。类转录激活蛋白(Transcription activator-like effectors,TALE)是广泛存在于黄单胞菌的一类效应蛋白,也是水稻白叶枯菌中的重要致病和无毒因子,由tal基因编码。作为毒力因子,TAL效应蛋白在病原菌入侵、从寄主细胞内获得养分及其增长和繁衍发挥重要的作用。了解白叶枯菌中的tal基因组成,克隆新的tal基因,研究其功能对于揭示白叶枯菌的致病机制具有重要的意义。本研究将已有的jxov基因文库中含有tal基因的粘粒克隆JV-7电转化白叶枯菌弱毒力菌株PH、强毒力菌株PX099A得到重组菌PH/JV-7、PX099A/JV-7。重组菌PH/JV-7在测定的22个水稻品种中的5个品种上的致病力比PH显著增强。重组菌PX099A/J V-7在测定的22个水稻品种中的12个品种上的致病力比PX099A显著增强。说明JV-7中含有具有毒力因子作用的基因。亚克隆了 JV-7中大小为3.3kb的BamHI酶切条带。序列测定分析发现,该片段含有一个tal基因,全长3345bp,编码1115个氨基酸的TAL蛋白,含有17.5个重复,将该基因命名为tal17.5。Blast分析发现,Ta117.5与Xoo中K74-14蛋白(基因登录号AKH66007.1)有99%的一致性,它们有完全相同的重复单元数目,RVDs也完全相同。K74-14蛋白的功能未知。将tal17.5电转化PX099A中,在寄主水稻与非寄主本氏烟上探究tal17.5基因的生物学功能。研究结果表明,在寄主水稻上tall7.5增强了 PX099A在水稻上的致病力,与JV-7增强PX099A在水稻上的致病力趋势相近。在NB培养基中PX099A/tal17.5的生长速率低于PX099A。测定对转入tal17.5呈现毒性增强的8个水稻品种上的细菌含量,发现PX099A/tal17.5比PX099A细菌含菌量显著增多,说明tal17.5促进了细菌在水稻中的生长。在非寄主本氏烟上发现PX099A/tal17.5引起的过敏反应与微过敏反应、烟草叶片细胞死亡数目、离子电导率、活性氧爆发和胼胝质沉积均较PXO99A弱,说明tal17.5基因的导入减弱了烟草对PX099A的防卫反应。tal17.5发挥的毒力作用可能是因为诱导了水稻上感病相关基因的表达。为了进一步了解tal17.5发挥毒力的机制,我们对水稻中与Tal17.5特异性结合的靶标DNA进行了初步研究。本研究利用TAL getter软件,根据Tal17.5的RVDs对在寄主水稻上的结合位点进行了预测。选取预测排名前3的EBE(EBES1、EBES2和EBES3),这3个EBE均与日本晴染色体上的DNA编码区重合。q-PCR检测发现,与PX099A相比,PX099A/tal17.5的接种对这3个EBE下游基因的表达有一定的诱导作用。以上结果说明Tal17.5与EBES1、EBES2、EBES3可能存在特异性的结合。为了进一步确定Ta117.5与寄主靶标的结合作用,我们构建了 Tall7.5的真核表达载体p1300Ta117.5 和 EBE 区域的报告载体 p1305EBES1、p1305EBES2、p1305EBES3。在烟草上共注射接种时,检测GUS基因的诱导表达情况。结果表明表达载体与报告载体共注射时,Tal17.5能够强烈地诱导GUS的表达。这进一步证实了 Tal17.5与上述3个EBE存在特异性的结合。但这些EBEs在Tal17.5的毒力体现中的具体作用有待进一步研究确认。

关键词：水稻白叶枯菌 jxov Tal17.5 毒力 EBE

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