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J亚群禽白血病病毒LAMP可视化检测方法的建立及应用

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J亚群禽白血病病毒LAMP可视化检测方法的建立及应用

作者：赵洲山东农业大学

学位级别：硕士

禽白血病是由禽白血病病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,j亚群虽然被发现的时间最晚,但其传染性和致病性都比其它亚群高,目前尚无有效的疫苗来防治,只能不断的淘汰阳性鸡,从而达到消灭本病的目的。实验室检测病原常用的分子生物学方... 详细信息

禽白血病是由禽白血病病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,j亚群虽然被发现的时间最晚,但其传染性和致病性都比其它亚群高,目前尚无有效的疫苗来防治,只能不断的淘汰阳性鸡,从而达到消灭本病的目的。实验室检测病原常用的分子生物学方法主要包括PCR技术、巢式PCR技术和荧光定量PCR技术,这3种方法虽然具有一定的作用,但是比较费时费力,对于操作人员的要求较高,无法满足简单快速诊断的要求。LAMP技术是一种全新的基因扩增方法,只需把模板、引物、酶、基质等共同置于一定温度下,经过一个步骤即可反应完成,根据扩增产物的有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。但是受制于该技术假阳性率高、结果判定需要开盖、可视化程度不高、操作过程可重复性较差等因素,LAMP技术目前很难进行推广使用,极大限制了该检测方法的使用范围。本研究拟结合该技术的最新研究趋势闭管操作与结果的可视化,建立一种检测J亚群禽白血病病毒的LAMP可视化检测方法。本研究首先对j亚群的禽白血病病毒SD0101株在DF-1细胞上进行扩增培养,使用EILSA方法和IFA技术来检测病毒在细胞上的增殖,根据Gen Bank已登录的J亚群禽白血病病毒gp85基因序列,人工合成后制备其DNA质粒模板ALV-j-gp85-p MD18-T,并用核酸蛋白分析仪测定了构建的阳性重组质粒ALV-j-gp85-p MD18-T的浓度,通过公式换算出拷贝数。使用在线设计软件设计出了针对J亚群禽白血病病毒的特异性LAMP引物,分别对引物比例、甜菜碱浓度、镁离子浓度、d NTP浓度、Bst酶浓度、反应温度、反应时间进行优化,筛选出最佳的ALV-j LAMP反应条件,最后在反应体系中加入防污染试剂和可视化试剂方便对反应结果进行判定,整个试验过程全程无需开盖,降低了污染的可能,保证了实验结果的准确性。通过与禽白血病病毒其他亚群的区分试验、特异性试验、灵敏性试验、重复性试验、临床样品的检测试验来检验本方法的可行性。试验结果表明,用IFA方法和ELISA方法证明了SD0101毒株在DF-1细胞上发生了增殖,构建的阳性质粒模板ALV-j-gp85-p MD18-T浓度为166 ng/μL,换算得到拷贝数为4×10copies/μL,通过对ALV-j LAMP反应体系的优化,确定了ALV-j LAMP反应最佳内外引物比例为8:1、甜菜碱浓度为4 M、镁离子浓度为6 m M、d NTP浓度为1.4 m M、Bst酶浓度为400 U/m L、最佳反应温度为64℃、最佳反应时间为54 min。通过规范化操作以及在反应体系加入1.4 m M的d UTP和0.01 U/μL的热敏UDG来减少LAMP反应产生的污染,最后在反应体系中加入1～3μL的SYBR系列荧光染料或NEB酚红试剂来对结果进行判定,加入SYBR荧光染料的阳性结果在紫外灯下呈现黄绿色,在体系中加入酚红试剂的阳性结果用肉眼观察呈现黄色。本研究建立的ALV-j LAMP可视化检测方法不与除j亚群外的其它禽白血病主要亚群发生交叉反应,同时也不与其它常见的禽类肿瘤性疾病发生非特异性反应,敏感性实验结果表明,ALV-j LAMP可视化方法比传统PCR方法敏感100倍,可以检测出的最小拷贝数为4×10copies/μL,检出的极限量为0.166 fg/μL。批内重复性试验和临床样品的检测结果也表明该方法具有良好的重复性,分别用ALV-j LAMP可视化检测方法和传统PCR方法对疑似禽白血病病毒感染的样品进行检测,两种检测方法的符合率为100%。综上所述,通过闭管操作、反应条件的优化和可视化试剂的使用,成功建立了针对J亚群禽白血病病毒的LAMP可视化检测方法,该方法具有成本低、特异性好、检测结果便于观察等优点,在实际使用中具有广泛的应用前景。

关键词： J亚群禽白血病病毒 LAMP 闭管操作结果可视化

沂蒙草鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传变异分析

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中国兽医杂志 2021年第2期57卷 7-12页

作者：牛建蕊王静王培坤薛聪韩照清于洋王媛张兴林临沂大学微生物与宿主健康研究所山东临沂276005 临沂市兰山区畜牧发展促进中心山东临沂276005

为了解山东沂蒙草鸡禽白血病病毒(ALV)感染情况,本试验从2个沂蒙草鸡规模化养殖场采集血浆样品184份,经DF-1细胞分离后利用ELISA试剂盒检测ALV-p27抗原。结果显示,有5份样品为ALV阳性(阳性率2.71%)。经分型引物鉴定,4份样品为A亚群禽白... 详细信息

为了解山东沂蒙草鸡禽白血病病毒(ALV)感染情况,本试验从2个沂蒙草鸡规模化养殖场采集血浆样品184份,经DF-1细胞分离后利用ELISA试剂盒检测ALV-p27抗原。结果显示,有5份样品为ALV阳性(阳性率2.71%)。经分型引物鉴定,4份样品为A亚群禽白血病病毒,1份样品为J亚群禽白血病病毒。对J亚群禽白血病病毒(命名为SDLYU1901)进行了全基因序列测定及分析,结果发现,j亚群病毒全基因组序列与江苏蛋鸡分离株jS09GY3相似性最高,为96.4%。分离株gag、pol基因较为保守,而env基因和3′UTR基因变异程度较大。其中gp 85基因与ALV-j参考株核苷酸相似性为89.7%~95.8%。3′UTR在rTM区以及DR1区域共出现205 bp的缺失。U3区序列分析结果显示,其与ALV-j原型株HPRS-103相似性最高,相似性为97.3%。试验结果表明沂蒙草鸡存在ALV感染,同时可为分析沂蒙草鸡ALV-j毒株分子特征及变异趋势提供数据支持。

关键词：沂蒙草鸡 J亚群禽白血病病毒分离鉴定全基因组

广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传进化研究

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中国家禽 2020年第1期42卷 28-33页

作者：王归燕莫国东阮灼豪谢婷婷张细权华南农业大学动物科学学院广东广州510642 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广东广州510642

为了解广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-j)净化情况,利用ALV-p27特异性抗原检测、病毒分离、PCR扩增和全基因组测序分析等方法,从广东某地方品种鸡群中分离鉴定出1株ALV-j,命名为GDYH-Y1。全基因组序列分析表明,GDYH-Y1分离株的LTR... 详细信息

为了解广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-j)净化情况,利用ALV-p27特异性抗原检测、病毒分离、PCR扩增和全基因组测序分析等方法,从广东某地方品种鸡群中分离鉴定出1株ALV-j,命名为GDYH-Y1。全基因组序列分析表明,GDYH-Y1分离株的LTR、gag和pol基因相对保守,而3′UTR和gp85基因变异较大,其中gp85基因与ALV-j参考毒株序列同源性仅为87.5%~92.8%,3′UTR区的rTM出现大量碱基缺失,遗传进化分析表明GDYH-Y1分离株与美国白羽肉鸡源分离株ADOL-7501亲缘关系最近。研究为广东地方品种鸡ALV-j净化效果提供数据参考,为分析广东地方品种鸡ALV-j毒株的分子特征和变异趋势提供了重要的数据资料。

关键词： J亚群禽白血病病毒分离与鉴定前病毒全基因组地方品种鸡

J亚群禽白血病病毒gp85蛋白的真核表达纯化及其生物学活性分析

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中国预防兽医学报 2017年第10期39卷 815-819页

作者：张瑶任超琪于蒙蒙高祥管晓璐祁小乐王永强刘长军王笑梅高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队黑龙江哈尔滨150069

gp85蛋白是禽白血病病毒(ALV)的囊膜表面蛋白,含有病毒-受体决定簇,通过识别和结合受体介导病毒侵入宿主细胞。为表达具有正确构象和生物学活性的j亚群ALV(ALV-j)gp85蛋白并对其生物活性进行分析,本研究以pCAGGS为载体,构建N端带有信号... 详细信息

gp85蛋白是禽白血病病毒(ALV)的囊膜表面蛋白,含有病毒-受体决定簇,通过识别和结合受体介导病毒侵入宿主细胞。为表达具有正确构象和生物学活性的j亚群ALV(ALV-j)gp85蛋白并对其生物活性进行分析,本研究以pCAGGS为载体,构建N端带有信号肽编码序列、C端融合Fc编码序列的gp85重组表达质粒pCAGGS-s-gp85-Fc,将其转染293T细胞进行瞬时表达,收集细胞培养液。SDS-PAGE结果表明,gp85-Fc蛋白高效表达,并且经Protein A亲和层析纯化得到高纯度的gp85-Fc蛋白。利用HRV 3C蛋白酶切除Fc标签并且进行分子筛纯化,得到纯度高于90%的gp85蛋白单体。经过流式细胞仪检测,表达的可溶性gp85蛋白能够与ALV-j受体特异性结合。病毒感染阻断试验结果显示,gp85蛋白能够通过封闭受体阻断ALV-j进入DF-1细胞,并且呈现剂量依赖性,在100μg/mL时仍能阻断70%以上的病毒侵入。本研究可溶性的、具有生物学活性的gp85蛋白的制备为体外研究病毒感染宿主细胞机制奠定了的基础。

关键词： J亚群禽白血病病毒 gp85 表达纯化生物学活性

J亚群禽白血病病毒SUj及兔IgGFc基因在腺病毒表达系统中的融合表达

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江苏农业学报 2016年第4期32卷 848-853页

作者：梅梅钱科唐应华秦爱建侯继波江苏省农业科学院江苏南京210014 扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 江苏省出入境检验检疫局江苏南京210001

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-j)囊膜蛋白gp85和兔IgGFc的融合蛋白,通过腺病毒表达系统融合表达ALV-j SUj和兔IgGFc(r IgGFc)基因。将pc DNA3.1-SUj-r IgGFc用XhoⅠ、KpnⅠ进行双酶切,获得SUj-r IgGFc基因,将其克隆至p Shuttle-CMV质粒... 详细信息

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-j)囊膜蛋白gp85和兔IgGFc的融合蛋白,通过腺病毒表达系统融合表达ALV-j SUj和兔IgGFc(r IgGFc)基因。将pc DNA3.1-SUj-r IgGFc用XhoⅠ、KpnⅠ进行双酶切,获得SUj-r IgGFc基因,将其克隆至p Shuttle-CMV质粒,构建穿梭载体p Shuttle-CMV-SUj-r IgGFc,重组质粒转化含p Adeasy-1的Bj5183-AD-1感受态细胞,获得重组腺病毒质粒p Ad-SUj-r IgGFc,最后转染人293T细胞。表达的融合蛋白可被ALV-j单克隆抗体jE9以及羊抗兔IgG识别,重组蛋白的分子量大小约9.5×104,且与jE9及羊抗兔IgG都有很好的反应性;免疫共沉淀试验结果显示融合蛋白可与DF1细胞膜蛋白混合物反应并获得差异蛋白。该融合蛋白可与ALV-j宿主细胞蛋白发生特异性反应。

关键词： J亚群禽白血病病毒 gp85基因兔IgGFc 腺病毒融合表达

禽戊型肝炎病毒与J亚群禽白血病病毒共感染诱发鸡大肝大脾病的分析

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中国家禽 2019年第17期41卷 72-75页

作者：郑高颖何书海张玉利张亚袁世玉薛婧雯庞宇成子强山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 信阳农林学院牧医工程学院河南信阳464000 济南市畜牧局技术推广站山东济南250306

为查明山东某种鸡场父母代种鸡出现产蛋下降、死亡率上升以及剖检所见肝脾肿大的原因,对发病鸡进行了PCR检测和组织病理学检查。PCR结果显示:被检10只鸡中8只为禽戊型肝炎病毒(HEV)阳性、5只为J亚群禽白血病病毒(ALV-j)阳性,HEV与ALV-j... 详细信息

为查明山东某种鸡场父母代种鸡出现产蛋下降、死亡率上升以及剖检所见肝脾肿大的原因,对发病鸡进行了PCR检测和组织病理学检查。PCR结果显示:被检10只鸡中8只为禽戊型肝炎病毒(HEV)阳性、5只为J亚群禽白血病病毒(ALV-j)阳性,HEV与ALV-j双阳性有4只。HEV与ALV-j共感染鸡的组织病理学检查发现:肝细胞坏死和汇管区周围淋巴细胞浸润,肝细胞内可见嗜酸性包涵体,同时部分肝内汇管区周围及肾脏间质可见髓细胞样瘤细胞,脑神经元坏死,肠绒毛脱落、坏死。检测结果提示本次蛋鸡大肝大脾病为HEV与ALV-j共感染引起。

关键词：禽戊型肝炎病毒 J亚群禽白血病病毒大肝大脾病共感染

GSK/β-catenin经典Wnt信号通路调控J亚群禽白血病病毒增殖研究

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GSK/β-catenin经典Wnt信号通路调控J亚群禽白血病病毒增殖研究

作者：乔丹丹扬州大学

学位级别：硕士

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus,RSV)引起禽类多种肿瘤性疾病的统称。禽白血病病毒属于反转录病毒科(Retroviridae),甲型反转录病毒属。禽白血病引起病禽... 详细信息

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus,RSV)引起禽类多种肿瘤性疾病的统称。禽白血病病毒属于反转录病毒科(Retroviridae),甲型反转录病毒属。禽白血病引起病禽的死亡、淘汰、造成多组织多种类型的肿瘤。近年来,禽白血病病毒致病机理研究一直是该病研究热点,国内外科学家围绕禽白血病病毒感染致病致瘤机理开展了大量的研究工作,获得了宝贵的科研进展。但到目前为止,禽白血病病毒感染致病致肿瘤的机理还了解不多,尤其病毒如何利用细胞内信号通路调控细胞炎症发生,细胞生物学变化,造成机体免疫抑制以及最终导致肿瘤的形成等研究领域知之甚少。最近研究发现HIV、EBV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及卡波济肉瘤相关疱疹等病毒的感染都能引起Wnt信号通路异常激活,最终导致癌症肿瘤的发生。家禽Wnt信号通路研究领域起步较晚,家禽组织中Wnt信号通路的部分组分已经发现并克隆。有报道表明,Wnt信号通路活化是家禽原始生殖细胞增殖所必需的。J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup j,ALV-j)感染引起的家禽生长发育迟缓是由于Wnt信号通路的下调引起。而经典Wnt信号通路与J亚群禽白血病病毒复制的关系还不清楚。本研究通过real-time PCR、Western blot和双荧光素酶报告系统等技术方法,并使用信号通路的激活剂和抑制剂,从基因转录和蛋白表达两个层面上重点研究GSK/β-catenin经典Wnt信号通路与J亚群禽白血病病毒复制的相关性,初步揭示Wnt信号通路对禽白血病病毒复制的影响,为全面解释禽白血病病毒的致病机理提供新的科学依据。1.激活经典Wnt信号通路有利于J亚群禽白血病病毒的增殖为了研究Wnt信号通路与ALV-j感染致病的关系,首先确定Wnt信号通路敏感的细胞模型为CEF细胞,然后采用信号通路激活剂GSK3 inhibitor X激活Wnt信号通路,检测信号通路相关分子的表达情况,J亚群禽白血病病毒编码蛋白表达情况,以及相关细胞炎症因子和抗病毒基因的表达情况。结果表明GSK3 inhibitor X能抑制GSK-3β活性,激活Wnt信号通路下游基因β-catenin、LEF1、TCF4、Axin2表达显著升高。同时病毒编码蛋白表达水平显著上升,病毒增殖显著加快,而这种变化可以被信号通路抑制剂iCRT14所干扰。细胞炎症因子IL-1β,IL-6,干扰素刺激因子OASL,ISG12-2以及抗病毒因子viperin表达都有不同程度的下降。细胞周期实验结果发现,信号通路激活剂GSK3 inhibitor X处理细胞后,S期细胞比例明显增加。综合以上实验结果表明,激活CEF细胞中的经典Wnt信号通路有利于ALV-j复制与增殖,这可能与Wnt信号通路调节细胞周期有关。2.抑制经典Wnt信号通路阻碍ALV-j的复制为了研究抑制经典Wnt信号通路对病毒复制的影响,本研究使用信号通路特异性抑制剂iCRT14处理CEF细胞,观察其对ALV-j复制的影响。实验结果显示,在CEF中iCRT14能极显著抑制ALV-j复制,并且呈现剂量依赖性。当使用iCRT14处理细胞后,Wnt通路下游基因β-catenin、LEF1、TCF4、CyclinD1、C-myc、Axin的表达也显著降低。细胞炎症因子IL-1β,干扰素刺激因子OASL的表达显著下降,而IL-6表达却显著增加。同时,细胞生长周期相关基因CDK6、CCNE1、CDK2都随着iCRT14剂量的增加呈现下降的趋势,细胞生长速率变缓。此外,本研究还利用siRNA干扰β-catenin表达抑制信号通路活化,此时的病毒表达同样受到抑制。这些结果表明抑制经典Wnt信号通路显著抑制J亚群禽白血病病毒在CEF细胞中的复制,这一作用可能同样与Wnt信号通路调节细胞周期有关。3.Wnt信号通路抑制剂在不同类型细胞中对ALV-j复制的影响已报道的研究表明Wnt信号通路在不同的细胞中可能呈现不同的生物学反应,因此本研究还选择了鸡肝癌细胞系LMH和鸡胚肾细胞CEK,研究Wnt信号通路抑制剂iCRT14对J亚群禽白血病病毒复制的影响。研究结果显示,ALV-j能够感染LMH和CEK细胞,使用抑制剂iCRT14处理细胞后,显著降低信号通路中β-catenin和CyclinD1基因的表达,同时ALV-j的复制也受到抑制。这一结果与CEF细胞结果一致,进一步说明抑制经典Wnt信号通路阻碍了J亚群禽白血病病毒的复制,其中具体的机制还需日后的研究来阐明。

关键词： Wnt信号通路 J亚群禽白血病病毒病毒增殖

致蛋鸡血管瘤J亚群禽白血病病毒cDNA全序列分析

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微生物学报 2010年第9期50卷 1264-1272页

作者：吴晓平秦爱建钱琨金文杰邵红霞朱钰峰沈海玉扬州大学兽医学院

【目的】了解近年来我国商品蛋鸡群中以血管瘤为主要表型的J亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus subgroup j,ALV-j）的分子生物学特性,为控制ALV-j在鸡群中流行提供基础资料。【方法】采用PCR扩增和序列分析技术,对分离自血管瘤或... 详细信息

【目的】了解近年来我国商品蛋鸡群中以血管瘤为主要表型的J亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus subgroup j,ALV-j）的分子生物学特性,为控制ALV-j在鸡群中流行提供基础资料。【方法】采用PCR扩增和序列分析技术,对分离自血管瘤或者血管瘤与髓样细胞瘤（Myeloid Leukosis,ML）并存的3株蛋鸡ALV-j毒株前病毒DNA的全序列及3株商品蛋鸡血管瘤型分离毒和1株商品蛋鸡ML型分离毒的致瘤关键性序列进行研究。【结果】来自血管瘤或者血管瘤与ML并存的商品蛋鸡分离毒株与来自肉鸡分离毒株的全序列差异明显,在遗传进化树上分属两个大的分支;研究发现商品蛋鸡血管瘤及ML混合病例分离毒jS09GY3与jS09GY6株的引物结合位点（Primer Binding Site,PBS）-Leader中出现极为罕见的连续19bp的插入突变,其与劳斯相关病毒1（Rous Associated Virustype1,RAV-1）、劳斯相关病毒2（Rous Associated Virustype2,RAV-2）及劳斯肉瘤病毒施密特-鲁宾二氏[Rous sarcoma virus（strain Schmidt-RuppinB）,RSV-SRB]毒株序列相同;通过对U3区调控元件的分析,发现血管瘤商品蛋鸡病例分离毒NHH与jS09GY5的U3区各发生1处连续序列缺失,出现了极为独特的c-Est-1、TCF11及C/EBP结合位点,这些调控元件可能与病毒的致肿瘤特性相关;所测的5株血管瘤商品蛋鸡分离毒均保留完整E元件,而所有肉鸡分离毒的E元件均发生了几乎相同的大部分序列缺失;首次发现血管瘤商品蛋鸡分离毒jS09GY3的E元件中有11bp的连续插入序列。【结论】商品蛋鸡血管瘤型ALV-j与肉鸡分离毒在全序列上差异明显,U3、DR1和E元件等区域有一部分特殊的突变与毒株的宿主类型和肿瘤表型有一定关系,其功能尚需进一步研究。而血管瘤型、髓细胞瘤型ALV-j可能是ALV-j与其它反转录病毒的重组毒。

关键词：血管瘤蛋鸡 J亚群禽白血病病毒全基因序列分析

诱发血管瘤型J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

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病毒学报 2011年第2期27卷 151-157页

作者：邱波刘功振王晓伟王峰陈洪博成子强山东农业大学动物科技学院山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室泰安271018 山东省医药工业研究所济南250033

2007年7月至11月,中国开产前后的商品海兰褐蛋鸡群大面积暴发血管瘤,造成巨大经济损失。将病料接种DF1细胞,通过PCR和间接免疫荧光(IFA)确定此次暴发的血管瘤为j亚群白血病病毒(ALV-j)感染引起。从患病鸡群中分离到5株ALV-j(前4株已经报... 详细信息

2007年7月至11月,中国开产前后的商品海兰褐蛋鸡群大面积暴发血管瘤,造成巨大经济损失。将病料接种DF1细胞,通过PCR和间接免疫荧光(IFA)确定此次暴发的血管瘤为j亚群白血病病毒(ALV-j)感染引起。从患病鸡群中分离到5株ALV-j(前4株已经报道),将第5株病毒命名为WS0705。为研究该毒株抗原性的特点,用PCR方法扩增出gp85基因,并克隆进pMD18-T载体进行测序。氨基酸系统进化树分析显示WS0705与英国ALV-j原型毒株HPRS-103同源性最高。从已构建的质粒pMD18-T-WS0705gp85中酶切回收gp85基因,构建重组转移载体pFastBacH Tb-WS0705gp85。利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-WS0705gp85。间接免疫荧光和Western blot检测WS0705gp85基因的表达产物。间接免疫荧光显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞呈现明显的强阳性反应;Western blot分析,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35kD的阳性条带。结果表明,WS0705gp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-j的特异性单抗jE9识别,进一步证明本次暴发血管瘤的病原为ALV-j,并为进一步开发ALV-j相关诊断产品奠定了基础。

关键词：血管瘤 J亚群禽白血病病毒 gp85基因克隆表达