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基于454与ion torrent平台的16S rRNA测序数据的比较分析与研究

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基于454与Ion Torrent平台的16S rRNA测序数据的比较分析与研究

作者：夏忠奎电子科技大学

学位级别：硕士

目前16S rRNA基因序列信息已经广泛应用于在菌种的鉴定和系统发生学研究领域。已经应用于16S rRNA测序的平台有Illumina、454以及最新出现的ion torrent PGM(Personal Genome Machine)。同一个样品用不同测序平台得到的结果不尽相同。... 详细信息

目前16S rRNA基因序列信息已经广泛应用于在菌种的鉴定和系统发生学研究领域。已经应用于16S rRNA测序的平台有Illumina、454以及最新出现的ion torrent PGM(Personal Genome Machine)。同一个样品用不同测序平台得到的结果不尽相同。如何降低由于测序平台所带来的偏差,使最终结果更加精确可靠,一直以来都是广大科学研究者所关注的。对于新出现的ion torrent PGM平台,我们首先构建一个基于该平台的16S rRNA分析流程。本课题采集饲喂8周后的6只小鼠的粪便样品并分别使用454焦磷酸测序仪(454 Life Sciences,Roche,USA)、ion torrent进行16S rRNA可变区域的测序。为了评价ion torrent的稳定性,将0121100852与0121100859两个样品重复三次测序,并分别运用正向测序(V4-V5可变区域)与反向测序(V5-V4可变区域);454为反向测序(V5-V3可变区域)。根据我们26个样品的测序数据量以及获得的OTU(操作分类单元,Operational taxonomic units)分布情况可以得知当每个样品反向测序V54的reads(测序片段)数达到30000左右基本会达到饱和的状态;ion torrent PGM正向测序V45由于读长比反向测序短一些,所以使得数据量饱和则需要更多的reads,我们建议正向测序每个样品需要40000左右的reads。ion torrent PGM正向测序的样品在纲、目、科水平上的注释比例要比反向的低些,在属和种水平上要比反向的高些。同一个样品重复测序在物种注释比例的比较、PCoA主坐标分析、普鲁克分析(Procrustes analysis)、beta多样性等方面展示的一致性都非常好从而说明了ion torrent PGM平台的测序稳定性很好。454焦磷酸测序仪在碱基质量值、reads读长方面要比ion torrent PGM测序平台更有竞争力;PGM与454反向测序的样品在OTU、门、纲、目、科、属、种水平上的丰度表(profile)结果的Procrustes相关性都比较高(0.783.9169)、PCoA主坐标分析以及beta多样性绘制的进化树显示同一样品来源的都聚在一起、permanova(非参数多元方差分析)分析发现测序平台因素p值为0.235,样品来源p值为0.001。结合以上,可以发现样品来源为主要差异因素,测序平台得到的结果差异不显著。同时,ion torrent PGM平台的reads注释到物种各个水平上的比例要比454平台稍微高一些(物种注释比例是评价测序数据质量的一个重要指标),显示了ion torrent PGM平台有自己一定的优势,另外考虑到这个新的测序平台的低成本、测序速度快等独特的优点,本论文认为ion torrent PGM平台完全可以取代454进行16S rRNA方面的分析。

关键词： 16S rRNA ion torrent 454 测序分析流程

基于ion torrent平台测序数据的微生物全基因组序列组装及分析方法

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基于Ion Torrent平台测序数据的微生物全基因组序列组装及分析方法

作者：徐晓蒙安徽医科大学

学位级别：硕士

微生物个体微小(直径小于0.1毫米),构造简单,包括细菌、放线菌、原生动物、藻类和原虫等,与人类日常生活、健康密切相关。微基因组作为遗传信息的携带者,是我们破译微生物生物学性状的核心密码。进行微生物基因组研究,对于了解微生物遗... 详细信息

微生物个体微小(直径小于0.1毫米),构造简单,包括细菌、放线菌、原生动物、藻类和原虫等,与人类日常生活、健康密切相关。微基因组作为遗传信息的携带者,是我们破译微生物生物学性状的核心密码。进行微生物基因组研究,对于了解微生物遗传机制、代谢过程以及一些微生物特殊功能如耐药性、致病性的遗传基础具有重要意义。作为微生物基因组学研究的基础,获得微生物全基因组序列显得重中之重。随着高通量测序技术的突飞猛进,测序通量大大提高,测序时间和成本不断降低,微生物全基因组测序也在飞速发展。然而,高通量测序的短读长又给全序的组装带来了新的困难。当前主流的高通量测序平台有三种:罗氏454公司的GS FLX+、Illumina公司的Hiseq及Miseq、Life公司的ion torrent。其中ion torrent高通量测序平台具有测序速度最快,操作简单、灵活和低成本等优点,是中等规模测序最佳选择,非常适合微生物这类小基因组的全基因组测序。本文以ion torrent平台测序数据为基础,全面探索了微生物全基因序列的组装过程以及遇到问题,并提出了相应的解决方法。全基因组序列组装类似于搭积木、玩魔方,简而言之,就是将零散的测序片段还原成完整的基因组序列的过程。基于ion torrent平台测序数据的特点,我们在组装算法和组装软件进行了选择,选择了基于OLC算法罗氏454公司推出的商业组装软件Newbler。而后在进行后续的基因组完成图时,我们又针对微生物基因组组装特点,选取了三种基因组组装辅助工具。其中ContigScape用来展示微生物基因组组装过程中由重复序列造成的contig之间的复杂关系,使得我们可以快速熟悉基因组结构的基本信息;基因组光学图谱用于指导序列组装,显著增加微生物基因组序列拼装质量,并对组装结果矫正分析;GapFiller用于补基因组内部的gap。综合以上的方法,我们建立了基于ion torrent平台测序数据微生物全基因组序列组装方法,其中也编写了很多个性化的程序用于简化流程,希望对没有基因组组装经验的科研人员有所帮助。此外,针对基因组序列组装中的重复序列问题,我们还建立的实时定量PCR法,通过简单的设计引物,PCR扩增,观察CT值就可以直接判断出contig位置关系,更省时间、精力,更重要的是节约成本,对二代测序数据组装,尤其是微生物基因组序列组装,有很大的意义。最后,我们也以COG注释、不同菌株基因含量比较、毒力基因的查找为例,简要的介绍了微生物基因组个性化的后续分析方法。综上,本文在现有方法基础上,利用ion Torren测序平台数据,进一步完善了微生物基因组序列组装流程,提出了更加简单、快捷的方法来解决组装过程中遇到的重复序列问题,也对全基因组序列进行了一些后续分析,简化了分析流程。文中提到的方法,均有实例对应。然而,针对不同的研究对象和要求,研究者仍需要具体问题具体分析。希望本文能够给其他科研人员以参考。

关键词：微生物高通量测序 ion torrent 基因组序列组装重复序列

ion torrent半导体测序联合MLPA技术检测神经纤维瘤患者的致病突变

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临床检验杂志 2023年第5期41卷 321-326页

作者：王玉国马定远刘刚张菁菁曾华沙罗春玉胡平许争峰南京医科大学附属妇产医院&南京市妇幼保健院遗传医学中心南京210004

目的建立临床适用的神经纤维瘤病(NF)的分子遗传分析方法,对NF进行分子遗传诊断和遗传咨询,并对NF家庭进行产前诊断。方法以南京医科大学附属妇产医院遗传咨询门诊收治的18例NF患者为研究对象,收集患者及其家属的外周血标本并提取基因组... 详细信息

目的建立临床适用的神经纤维瘤病(NF)的分子遗传分析方法,对NF进行分子遗传诊断和遗传咨询,并对NF家庭进行产前诊断。方法以南京医科大学附属妇产医院遗传咨询门诊收治的18例NF患者为研究对象,收集患者及其家属的外周血标本并提取基因组DNA,应用ion torrent半导体测序技术进行NF1/NF2基因测序并结合多重连接探针扩增反应(MLPA)检测,筛选致病突变并用Sanger测序验证,结合亲子二代的分子遗传检测结果,制定适当的临床干预和随访计划。在NF家系母亲再次妊娠时,对胎儿进行产前诊断。结果应用ion torrent半导体测序技术检测出9例致病突变和1例可疑致病突变,其中包括3个未报道过的新突变;应用MLPA技术检测出1例拷贝数大片段缺失。对其中5个家系的孕妇行羊膜腔穿刺术抽取羊水进行产前诊断,其胎儿均不携带家系的致病突变。结论基于ion torrent半导体测序及MLPA技术建立的基因诊断方法可为NF临床诊断及遗传咨询提供分子遗传学依据,具有较高的临床应用价值。

关键词：半导体测序神经纤维瘤病 ion torrent NF1/NF2基因

基于iontorrent测序平台的肿瘤用药指导检测及临床应用

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基于IonTorrent测序平台的肿瘤用药指导检测及临床应用

作者：洪英财暨南大学

学位级别：硕士

1.目的基因检测目前已经是肿瘤治疗中，特别是靶向药用药前不可以缺少的一部分。现有方法主要是基于Sanger测序技术。随着新一代测序技术的发展，这种快捷、高通量、高灵敏度的测序方法正在逐渐走向临床。本文通过对2例肺癌组织样本... 详细信息

1.目的基因检测目前已经是肿瘤治疗中，特别是靶向药用药前不可以缺少的一部分。现有方法主要是基于Sanger测序技术。随着新一代测序技术的发展，这种快捷、高通量、高灵敏度的测序方法正在逐渐走向临床。本文通过对2例肺癌组织样本和5例肺癌病人血浆样本在ion torrent上进行测序分析，证实基于ion torrent测序平台的肿瘤用药指导测序是可靠的。找到潜在的导致两例病人服用厄洛替尼效果差异原因，并验证从血浆中检测肿瘤体细胞突变的可行性。 2.方法 1.提取DNA及测序。从2例肺癌样本（1例厄洛替尼效果好和1例厄洛替尼效果差）和5例肺癌术前血浆样本（对应的组织样本已经有sanger检测的结果）中提取DNA。 2．根据Life Technology Cancer Panel标准流程对DNA样本使用多重PCR富集，得到DNA片段经过纯化、建库之后在ion torrent上进行测序。 3.对测序数据进行分析。 4.对2例肺癌组织样本的突变结果进行信号通路综合分析，从而得到潜在的导致两个病人使用厄洛替尼后效果不同的原因。 5.将5例血浆样本及其对应组织样本的突变同已知的组织样本的突变比较分析，观察是否在血浆中可以检测到对应的突变。 3.结果： 1.检测结果的特异性分析：对2例组织样本突变检测结果进行Sanger测序验证，验证率100%。将5例血浆样本突变检测结果和已知Sanger检测结果做比较，检出率100%，最低的一个样本5.4%的突变频率可检出。 2.临床意义解读：对2例组织样本突变检测结果涉及的基因进行了综合分析，从信号通路的角度进行解读，在厄洛替尼无效的病人中发现MET上的一个非同义突变可能是其无效的潜在原因。 4.结论血浆突变检测实验中，我们在患者术前血浆中检测到的突变与手术切下的组织中一致。说明了在血浆中检测肿瘤体细胞突变的可行性。这一成果对晚期无法手术病人的用药指导有非常大的意义。在使用ion torrent Cancer Panel突变检测时，除了常见的EGFR,KRAS,BRAF,KIT等常见靶向性药物相关基因，还可以同时检测MET,ALK,APC,PIK3CA,PTEN等基因突变，可以更全面指导患者用药，找出更适合患者的药物，且可以同时针对多种癌症进行检测。我们通过对两例在传统方法上基因相同，实际用药效果却不同的样本的测序分析，找到潜在导致他们表型不一致的原因。

关键词：肿瘤血浆用药指导 ion torrent Cancer Panel

Development of a TCR beta repertoire assay for profiling liquid biopsies from NSCLC donors

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Cancer Drug Resistance 2020年第3期3卷 563-571页

作者： Leisa P.Jackson Benjamin A.Tjoa Hestia Mellert Gary A.Pestano Development Biodesix Inc.BoulderCO 80301USA. Cellero LLCBothellWashingtonWA 98021USA.

Aim:The aim of this study was to demonstrate the utility of T-Cell receptor beta(TCRβ)sequencing as a robust method for assessing T-cell repertoire changes in donors with non-small cell lung cancer(NSCLC).We further demonstrated the use of the assay by monitoring repertoire modulation in a defined model antigen system,cytomegalovirus(CMV).Methods:Peripheral blood mononuclear cells from four healthy donors were challenged with a 1-week exposure to whole-cell lysate from CMV-infected cells or CMVpp65495-503 peptide(NLVPMVATV).T-cell repertoire perturbations were assessed using the Oncomine TCR Beta-SR Assay and ion GeneStudio S5 Plus Sequencer.A pp65 tetramer flow cytometry assay was used as an orthogonal method to assess clonal expansion of a subset of CMV-specific *** evaluation of the assay in peripheral blood lymphocytes from NSCLC donors,five whole blood specimens were evaluated using the same sequencing ***:The TCR beta assay identified 6,683-61,936 unique clones from 1-2 million reads per sample,and an average of 80%of the total reads were usable for TCR *** the NSCLC donors,TCR convergence and clonality values were consistent with published results and ranged 0.016-0.033 for convergence and 0.09-0.48 for *** the CMV study,TCR sequencing detected the expansion of a common family of clones in all 4 samples in response to antigen *** expansion corresponded to an increase in pp65 tetramer staining by flow *** TCR convergence scores ranged 0.009-0.041 and increased 5-fold in one sample as a result of pp65 antigen ***:The results of this study demonstrated the utility of profiling of the TCRβrepertoire in a model system and in donors with ***,we demonstrated the correlation between RNA-seq methods and protein-tetramer analysis using flow *** techniques represent an emerging solution that could complement other liquid and tissue diagnostic assays in the cl

关键词： TCRβ liquid biopsy ion torrent immunotherapy

北京市朝阳区1例输入性SARS-CoV-2全基因组序列分析

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病毒学报 2020年第5期36卷 745-750页

作者：韩桃利王海滨焦洋雷娜高艳赵剑虹田甜董歧段杉孙灵利北京市朝阳区疾病预防控制中心北京100021

北京市朝阳区在连续40d没有新增本土COVID-19确诊病例的情况下,出现了1例潜伏期超过14d的境外回国COVID-19确诊病例。为分析北京市朝阳区1例COVID-19患者是否为输入病例,进行了全基因组序列测定和遗传特性分析,本研究采用高通量测序技... 详细信息

北京市朝阳区在连续40d没有新增本土COVID-19确诊病例的情况下,出现了1例潜伏期超过14d的境外回国COVID-19确诊病例。为分析北京市朝阳区1例COVID-19患者是否为输入病例,进行了全基因组序列测定和遗传特性分析,本研究采用高通量测序技术配合ion torrent系列仪器和试剂对患者咽拭子中的SARS-CoV-2进行测序,同时应用对应插件或软件分析其全基因组同源性和变异情况。结果显示,该病例标本中测得1株SARS-CoV-2毒株,共29 876 bp,BLAST结果显示与其他国家和地区分离株的相似性高于与中国分离株的相似性。系统进化树中该毒株与2003年感染人的SARS冠状病毒和蝙蝠中分离的SARS冠状病毒明显不同,分处不同进化分支;该毒株与中国分离株分处不同的簇,而和美国分离株聚集在一簇。另外,突变分析显示存在3个改变氨基酸性质的非同义突变。本研究提示,该病例为美国输入的SARS-CoV-2感染病例,应注意境外输入性COVID-19的传播,并适当延长隔离观察期限;该毒株在患者的1例关联病例中发生了部分核苷酸突变,对SARS-CoV-2的致病力等的影响有待进一步研究。

关键词： SARS-CoV-2 COVID-19 高通量测序 ion torrent 输入病例

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紫花苜蓿盐碱胁迫下的转录组测序分析

紫花苜蓿盐碱胁迫下的转录组测序分析

中国生物工程学会第十届学术年会暨2016年全国生物技术...

作者：安逸民宋丽莉刘英蕊郭长虹哈尔滨师范大学

盐碱胁迫在世界范围内对农业生产造成了广泛的影响。紫花苜蓿是一种豆科多年生牧草,在世界范围内广泛种植,一些地方品种对盐和盐碱胁迫具有一定的抗性。为了探索植物对盐碱胁迫的耐受机制,本研究对紫花苜蓿幼苗进行了盐碱胁迫下0天,1天... 详细信息

盐碱胁迫在世界范围内对农业生产造成了广泛的影响。紫花苜蓿是一种豆科多年生牧草,在世界范围内广泛种植,一些地方品种对盐和盐碱胁迫具有一定的抗性。为了探索植物对盐碱胁迫的耐受机制,本研究对紫花苜蓿幼苗进行了盐碱胁迫下0天,1天和7天的转录组测序分析。在测序结果中,共获得了53,853个unigene,其中在1天和7天处理下,分别存在2,286和2,233个显著差异表达基因,主要富集于14个GO标签中,初步揭示了植物在短期和长期胁迫应答中的响应通路,包括活性氧代谢,类黄酮代谢,光通路等。其中,109个和96个转录因子分别在1天和7天处理下显著改变了表达模式。相对于盐胁迫响应的数据,本研究筛选了18个在盐和盐碱胁迫下响应存在差异的基因,包括NAC基因,醛酮还原酶,GST等基因,同时通过对植物胁迫下ROS,MDA和叶绿素含量等的生理测定发现,相对盐胁迫,植物抗氧化通路和脱毒通路在盐碱胁迫下十分活跃,可能对植物耐盐碱机制具有重要作用。综上所述,本研究对紫花苜蓿耐盐碱机制的探索提供一个新的视角。

关键词：紫花苜蓿 ion torrent 转录因子过氧化物酶类黄酮盐碱胁迫

来源： cnki会议评论

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紫花苜蓿盐碱胁迫下的转录组测序分析

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