检索结果-南通市图书馆

Analysis of the characteristic sequence of intein and revision of its motifs

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

Chinese Science Bulletin 2001年第9期46卷 758-761页

作者： Jun Xie Jingfei Huang Xiufan Shi Ciquan Liu Chinese Acad Sci Kunming Inst Zool Kunming 650223 Peoples R China

Since the first intein (Sce VMA) was found in Saccharomydes cerevisiae ATPases gene in 1990, more and more inteins were identified. It is necessary to analyze the new inteins to understand the sequence charateristics of inteins. By searching protein and nucleic acid database systematically, 101 inteins were found, of which 69 inteins contain homing endonuclease motifs. We only analyze the 69 inteins since most inteins are the classic inteins with homing endonuclease motifs. We found that the distribution of these inteins is particular among species and protein. By multiple sequence alignment, some new sequence characteristics were found and the motifs described previously were revised.

关键词： intein distribution location of intein sequence charateristics.

大肠杆菌BL21(DE3)中DnaE intein介导ABCA1蛋白的连接

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学报 2009年第12期49卷 1601-1606页

作者：朱甫祥缪静屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院烟台264025

【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的12... 详细信息

【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的123个氨基酸的N端和36个氨基酸的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)。转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达后观察重组蛋白的表达和ABCA1的连接。【结果】转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示预期大小的ABCA1剪接蛋白条带,并进一步为His-Tag抗体进行的Western blotting证实。【结论】结果表明SspDnaEintein可有效催化ABCA1的连接,为进一步研究利用双腺相关病毒(AAV)载体转运ABCA1基因,克服单个AAV载体容量限制进行由ABCA1基因突变所致Tangier病的基因治疗奠定了基础。

关键词： DnaE intein 蛋白质反式剪接 ABCA1 连接

引入糖基化位点和L303E/F309S突变促进intein介导的断裂凝血Ⅷ因子剪接

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

药学学报 2010年第11期45卷 1361-1366页

作者：朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院山东烟台264025

作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌... 详细信息

作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌和活性的影响。用分别融合Ssp DnaB intein的重链变体(DMN6HCIntN)和轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA分析分泌至培养上清液中的剪接BDD-FVIII蛋白量,并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性。结果显示,DMN6HCIntN和IntCLC共转基因细胞上清液中剪接BDD-FVIII的浓度为(149±23)***-1,活性为(1.12±0.14)***-1,明显高于intein融合的野生型重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)共转基因细胞[(99±14)***?1和(0.77±0.13)***?1],提示重链变体能明显促进剪接BDD-FVIII蛋白的分泌和活性;另外,还检测到不依赖细胞机制的BDD-FVIII剪接。本研究为进一步动物体内双AAV载体转BDD-FVIII基因研究提供了依据。

关键词：凝血VIII因子重链变体分泌 intein 蛋白质剪接

vWF促进intein剪接的BDD-FVⅢ的分泌和活性

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

药学学报 2010年第5期45卷 595-600页

作者：朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院山东烟台264025

vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整... 详细信息

vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII蛋白。为了研究vWF对于intein连接的BDD-FVIII分泌和活性的影响,通过intein融合的BDD-FVIII重、轻链基因和vWF基因共转染培养的293细胞,采用ELISA观察了分泌至培养上清液中的由intein剪接的全长BDD-FVIII抗原量,并用Coatest检测了由其产生的活性。结果显示,vWF基因共转染细胞上清液中,全长BDD-FVIII抗原量为(235±21)ng·mL-1,活性为(1.98±0.2)u·mL-1,明显高于未转染vWF的细胞[(110±18)ng·mL-1和(1.10±0.15)u·mL-1],也明显高于单独转染BDD-FVIII基因的对照细胞[(131±25)ng·mL-1和(1.22±0.18)u·mL-1],表明vWF基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII基因后intein剪接的BDD-FVIII蛋白的分泌和生物活性。为基于蛋白质剪接的断裂BDD-FVIII基因转移的甲型血友病基因治疗研究中,应用vWF基因共转移以提高治疗的功效提供了依据。

关键词： von Willebrand因子凝血VIII因子共转染分泌 intein 蛋白质反式剪接作用

intein介导的天然大腹园蛛MiSp重复区基因在毕赤酵母的表达研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Intein介导的天然大腹园蛛MiSp重复区基因在毕赤酵母的表达研究

作者：杨子江东华大学

学位级别：硕士

蜘蛛丝(Spider silk)是一种天然蛋白纤维材料,因其卓越的材料学性质被广泛认知。同时,作为一种生物大分子多聚物,有着良好的生物兼容性且易于生物降解,被越来越多的用于药载运输和细胞组织工程等多领域的研究。圆网蜘蛛可分泌六种蛛丝纤... 详细信息

蜘蛛丝(Spider silk)是一种天然蛋白纤维材料,因其卓越的材料学性质被广泛认知。同时,作为一种生物大分子多聚物,有着良好的生物兼容性且易于生物降解,被越来越多的用于药载运输和细胞组织工程等多领域的研究。圆网蜘蛛可分泌六种蛛丝纤维,其中次壶腹腺丝(又称临时捕获丝)主要用于加固蛛网和捕猎等,具有和牵引丝相似的优良品质,但不同的是,在水环境中临时捕获丝不发生超收缩现象,这一特点使其具有特殊的应用价值。但是,由于蜘蛛自身同类相残的习性,以及产丝量小的特点,无法通过大规模人工饲养的方法来获取蛛丝纤维。随着基因工程的快速发展,越来越多研究尝试利用基因重组表达和后期放生的方法来获取人造蛛丝为了进一步解析蛛丝蛋白质结构与功能,探索蛛丝蛋白成丝机理,制备良好的仿生材料储备大量可溶蛛丝蛋白。本课题旨在酵母表达体系中分段表达次壶腹腺丝基因,之后通过intein介导的体外拼接技术,获得天然的全长次壶腹腺丝蛋白产物。为此,本研究通过PCR扩增获得大腹园蛛Misp天然基因,以其内部intron为界分为两段,分别融合his-tag及split-intein的N端或C端,构建了4对不同的表达克隆。尝试在Pichia pastoris表达,优化,纯化,获得较高表达水平,进而通过split-intein的体外剪接,将两段蛋白产物以肽键连接起来,以期获得全长蛋白。本研究中,采用两种菌株、两种intein成功构建了4对克隆并在Pichia pastoris实现其中一对GS115:P1-SXN, GS115:P2-SXC表达,纯化。在对P1-SXN序列表达的过程中,在Pichia pastoris中摸索表达条件,对其进行优化;同时,在E. coi1中和实现了对照组BL21(DE3):P1-PKT的表达,并以此作为参照,通过SDS-PAGE和Western blot analysis,比对了两种表达系统Pichia pastoris和E. coi1对Misp天然基因表达情况。结果表明P1-SXN在两种表达系统中均可实现可溶性表达,而GS115经初步优化,表达产量能达到原来的6-7倍,是BL21DE3)的2-3倍,而纯化效率是BL21(DE3)的5-7倍。由此证明,Pichia pastoris表达系统更适合重复度高以及富含Gly/Ala的天然蛛丝编码基因的表达。同时,在对GS115:P2-SXC表达过程中发现,由于其携带的intein:sx-sO的原因,容易出现断裂等现象,影响后续实验的进行。因此本研究需要继续尝试另外3对克隆的表达,在现有实验的基础上,进一步优化,扩大培养,获得足够的目的蛋白,实现intein的体外拼接,获得天然的全长蛋白。本研究为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。

关键词：次壶腹腺丝基因(Misp) intein E.coil 表达系统 Pichia pastoris表达系统

inteins--A Focus on the Biotechnological Applications of Splicing-Promoting Proteins

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

American Journal of Molecular Biology 2015年第2期5卷 42-56页

作者： Manfredi Miraula Charmaine Enculescu Gerhard Schenk Natasa Mitic Department of Chemistry Maynooth UniversityMaynoothIreland School of Molecular and Microbial Biosciences The University of QueenslandSt.LuciaQueenslandAustralia

The main aim of this mini-review is to illustrate strategies and industrial applications based on inteins (INTErnal proteINS), which belong to a class of autocatalytic enzymes that are able to perform a catalytic reaction on a single substrate. However, since practical applications of inteins are strongly guided by a detailed understanding of their biological mechanisms and functions, the first part of this review will thus briefly discuss the physiological roles of inteins, describing what is currently known about their mechanisms of action. In the second part, specific biotechnological applications of inteins will be outlined (i.e. their use for (i) the purification of recombinant proteins, (ii) the cyclization of proteins and (iii) the production of seleno-proteins), paying attention to both potential strengths and weaknesses of this technology.

关键词： intein Protein Purification Tagged Protein Cyclization Selenoprotein

A novel recombinant,VPAC2-selective agonist enhancing insulin release and glucose disposal

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

Acta Pharmacologica Sinica 2007年第4期28卷 526-533页

作者： Ngai-lik TAM Bio-engineering Institute of Ji-nan University

Aim:To obtain the recombinant,VPAC2-selective ( VPAC2:type 3 receptor ofpituitary adenylate cyclase activating polypeptide which shared by vasoactiveintestinal peptide) agonist with effects on glucose disposal by intein-mediated,single column ***:A gene encoding 32-amino acid peptidenamed rMBAY was designed and synthesized and cloned into Escherichia coliexpression vector,pKYB (NEB,USA).The recombinant vector was transferredinto E coli ER2566 strain and the target protein was overexpressed as a fusion tothe N-terminus of a self-cleavable affinity *** the fusion protein was puri-fled by chitin-affinity chromatography,the self-cleavage activity of the intein wasinduced by β-mercaptoethanol and the target peptide,rMBAY,was released fromthe chitin-bound intein ***:Approximately 53 mg rMBAY with the purityover 95% was obtained by single column purification from 1 L induced culturefermented in 5 L *** results of the competitive binding assay andcAMP accumulation assay indicated that the recombinant rMBAY had specialbinding selectivity and potency for *** recombinant peptide,rMBAY,enhanced insulin release and decreased the plasma glucose level after intraperito-neal injection (50 ng/kg) with a high concentration of glucose (1.8 mmol/kg) in theNIH ***:An efficient production procedure of a recombinant VPAC2-selective agonist with corresponding effects on glucose disposal was established.

关键词： intein recombinant VPAC2 agonist insulin

Protein trans-splicing based dual-vector delivery of the coagulation factor Ⅷ gene

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

Science China(Life Sciences) 2010年第6期53卷 683-689页

作者： ZHU FuXiang,LIU ZeLong,CHI XiaoYan & QU HuiGe Life Science College of Ludong University,Yantai 264025,China Life Science College of Ludong University Yantai China

A dual-vector system was explored for the delivery of the coagulation factor VIII gene,using intein-mediated protein trans-splicing as a means to produce intact functional factor VIII post-translationally.A pair of eukaryotic expression vectors,expressing Ssp DnaB intein-fused heavy and light chain genes of B-domain deleted factor VIII (BDD-FVIII),was *** transient co-transfection of the two vectors into 293 and COS-7 cells,the culture supernatants contained (137±23) and (109±22) ng mL–1 spliced BDD-FVIII antigen with an activity of (1.05±0.16) and (0.79±0.23) IU mL–1 for 293 and COS-7 cells,*** spliced BDD-FVIII was also detected in supernatants from a mixture of cells transfected with inteinfused heavy and light chain *** spliced BDD-FVIII protein bands from cell lysates were visualized by Western *** data demonstrated that intein could be used to transfer the split factor VIII gene and provided valuable information on factor VIII gene delivery by dual-adeno-associated virus in hemophilia A gene therapy.

关键词： intein protein trans-splicing coagulation factor VIII dual-vector gene delivery

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

蛋白内含子介导纯化的表达载体的构建及应用

生物技术 2004年第4期14卷 13-16页

作者：张云龙张众王飞陈毓荃黄华樑西北农林科技大学陕西杨陵712100 中国科学院遗传与发育研究所北京100101

将抗膀胱癌单链抗体 (PG)融合在蛋白内含子 (intein)的C末端 ,利用intein的N末端具有的chitinbindingdomain(CBD)对几丁质柱的吸附特性及intein的自切割活性对PG进行一次性纯化。同时 ,引入大肠杆菌分子伴侣肽基脯氨酰顺反异构酶 (Fk pA... 详细信息

将抗膀胱癌单链抗体 (PG)融合在蛋白内含子 (intein)的C末端 ,利用intein的N末端具有的chitinbindingdomain(CBD)对几丁质柱的吸附特性及intein的自切割活性对PG进行一次性纯化。同时 ,引入大肠杆菌分子伴侣肽基脯氨酰顺反异构酶 (Fk pA)与目的蛋白进行共表达及融合表达 ,以使目的蛋白以可溶形式存在。结果显示 ,PG融合蛋白对几丁质柱的吸附效率很高 ,in tein的自切割释放PG的效率也较高 ,但PG仅出现在SDS洗脱液中。FkpA与PG共表达能显著地提高目的蛋白的可溶性。intein介导的纯化系统前景远大。

关键词：单链抗体 intein CBD FkpA pTWIN 纯化