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人正常肝细胞过氧化损伤时受体及受体后水平胰岛素抵抗现象

人正常肝细胞过氧化损伤时受体及受体后水平胰岛素抵抗现象

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作者：徐建华南方医科大学

学位级别：硕士

背景：胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病、冠心病、高血压等慢性疾病的共同机制及危险因素。有研究发现创伤应激等条件下,机体亦表现出一定程度的胰岛素抵抗并直接影响大手术、创伤的预后。近年来,胰岛素抵抗与缺血再灌... 详细信息

背景：胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病、冠心病、高血压等慢性疾病的共同机制及危险因素。有研究发现创伤应激等条件下,机体亦表现出一定程度的胰岛素抵抗并直接影响大手术、创伤的预后。近年来,胰岛素抵抗与缺血再灌注相关性的研究逐渐成为新点、热点之一,有研究证实肝脏缺血再灌注后存在高血糖现象,其产生机制众说不一：Zanaro NL[3]认为是肝缺血再灌注过程中所产生的炎性细胞因子(如TNF-a等)继发性地诱导内源性儿茶酚胺、皮质醇和胰高血糖素等抗胰岛素激素分泌引起的结果;Choi CS[4]认为是恢复血流前使用大剂量类固醇激素所致;Nowsk G[5]认为是肝脏贮存的肝糖元分解、集中释放所致。胰岛素抵抗包括受体前、受体、受体后三个水平,受体前水平IR主要与在体各种抵抗激素的释放有关,而受体及受体后水平IR主要与胰岛素-胰岛素受体(insulin receptor,IR)-受体底物(IR substrates,IRSs)-PI3-kinase-蛋白激酶B(phospho-Protein Kinase B,PKB/AKT)信号系统有关。有研究显示,此信号系统任何靶蛋白分子表达下降均可以引起胰岛素抵抗。胰岛素受体锚定在细胞膜上,细胞膜流动性及结构的破坏势必会损害细胞膜功能,进而影响胰岛素受体表达。因此,同步检测培养基中残余葡萄糖含量,反映细胞膜改变的Annexin-V表达、细胞形态学改变、细胞增殖抑制率变化等指标,有可能在一定程度上反映出细胞是否出现受体水平的胰岛素抵抗现象。胰岛索受体由α、p各两个亚基组成,其中p亚基是发挥胰岛素细胞膜与细胞内效应的功能单位,因此该指标是反映受体水平胰岛素抵抗的特异性敏感指标。AKT时胰岛素信号通路上的关键信号分子,它的磷酸化可激活葡萄糖转运子,进而启动葡萄糖由膜外向膜内转运,因此,通过在检测上述指标同时,同步观察P-AKT的表达变化可以反映出受体后水平的胰岛素抵抗现象。本课题组前期动物实验研究已初步证实,大鼠肝缺血再灌注时,可出现受体前水平的胰岛素抵抗现象(论文待发表)。肝脏的缺血再灌注损伤本质上主要是因缺血缺氧、脂质过氧化自由基大量生成造成的肝实质细胞遭受过氧化损伤,离体肝实质细胞在过氧化损伤时是否存在胰岛素抵抗现象尚有待进一步证实。为证实过氧化损伤是否确实会引发肝细胞出现胰岛素抵抗现象,以及其发生机制,本课题试图在体外实验中利用过氧化氢(H202)处理人正常肝细胞(L02细胞)制作过氧化损伤模型,观察L02细胞在遭受过氧化损伤时过氧化损伤指标丙二醛(MDA)、胰岛素抵抗指标培养基中残余葡萄糖、凋亡指标膜联蛋白V (Annexin5)表达、细胞的生存率及细胞形态学的变化、insrβ及AKT的表达,证实L02细胞过氧化损伤时是否存在受体及受体后水平葡萄糖利用障碍的胰岛素抵抗现象,初探其可能机制,为临床上防治缺血再灌注损伤提供新思路。材料和方法： 1.材料：L02细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉),过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司,Dmem/High Glucose培养基和改良型RPMI-1640培养基购自Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;批次号：110311;胰酶购自Amresco,货号：0457;葡萄糖测定试剂盒购自上海名典生物工程有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒购自南京建成科技有限公司。 2.细胞培养：①培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时进行传代。②吸弃原有培养基,加入2ml的PBS清洗细胞后弃掉。③加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行),消化1-2分钟。④细胞都变圆后吸出胰酶终止消化。⑤加入3ml的完全培养基,移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。⑥把细胞传到3个相同规格的培养瓶中,置于37℃,5%C02培养箱中继续培养。⑦以生长稳定的3-5代细胞制备细胞悬液,接种于6孔板,每孔细胞数约为5×105个,用于实验。 3.实验分组：实验设3组：①A组：L02细胞正常培养24h不加H2O2处理,②B组：L02细胞正常培养24h后力160μmol/LH2O2,③C组：L02细胞正常培养24h后加入517μmol/LH202。分别于0、12、24h收集细胞及上清,采样待测。 4.过氧化损伤模型的制作：预实验——用不同浓度的H202作用于L02细胞,Oh、12h、24h后MTT试验计算其抑制率,据结果选取合适的浓度160μmol/LH2O2(24h抑制率为35.8%)、517μmol/L(24h抑制率为50%)用于试验。接种细胞于6孔板,培养24h后,分别加入不同浓度的H202,制作不同程度的细胞过氧化损伤模型。 5.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测细胞上清液残余葡萄糖含量：将试剂1与

关键词： LO2细胞过氧化损伤胰岛素抵抗 insrβ p-AKT

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