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中国兽医学报 2014年第9期34卷 1448-1452页

作者：徐姗姗孙菲菲吴亚荣叶红李槿年刘雪兰安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室安徽合肥230036 中国农业大学动物医学院北京100083 安徽省医学科学研究所安徽合肥230061

跨膜糖蛋白恒定链在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(ii-key)在此过程中发挥重要作用。为了研究ii-key携带异种病毒抗原表位能否有效增强机体的免疫应答,本试验首先构建ii... 详细信息

跨膜糖蛋白恒定链在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(ii-key)在此过程中发挥重要作用。为了研究ii-key携带异种病毒抗原表位能否有效增强机体的免疫应答,本试验首先构建ii-key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位(aa197-209)和新城疫病毒HN肽表位(aa345-353)的嵌合体,并将嵌合体基因插入pET-32α原核表达载体,转化*** Rosetta诱导表达,用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫SPF级BALB/c小鼠,分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明,与VP2/HN串联表位对照组相比较,ii-key/VP2/HN嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。通过将嵌合体基因导入pmCherry-C1真核表达载体与pEGFP-N1-MHCⅡα共转染293T细胞,结果表明ii-key/VP2/HN嵌合体与VP2/HN和空载体蛋白在细胞内均呈现弥散状,与MHCⅡ类分子共定位无明显差异。综上所述,ii-key能够携带异种病毒串联抗原表位有效增强免疫应答,其增强机制还有待于进一步研究。

关键词： ii-key 嵌合体疫苗抗体水平细胞转染

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ii-key和PEP-1携带异种病毒表位嵌合疫苗的构建及其体液免疫效应

Ii-Key和PEP-1携带异种病毒表位嵌合疫苗的构建及其体液免疫效应

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作者：徐姗姗安徽农业大学

学位级别：硕士

跨膜糖蛋白恒定链(invariant china, ii)在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)ii类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(ii-key)在此过程中发挥重要作用。近些年,ii-key已被证实能够携带单一抗原或抗原肽,有效增强... 详细信息

跨膜糖蛋白恒定链(invariant china, ii)在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)ii类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(ii-key)在此过程中发挥重要作用。近些年,ii-key已被证实能够携带单一抗原或抗原肽,有效增强细胞免疫和体液免疫。PEP-1是一种人工设计的细胞膜穿透肽(Cell penetrating peptide,CPP),具有克服细胞膜的屏障作用跨膜转导能力,以非能量、非受体依赖性的方式把蛋白质、肽段、寡核苷酸等跨膜转导入各种细胞的胞浆和胞核内。本文基于ii-key和PEP-1载体上构建异源多表位串联肽新型疫苗,为双重防控鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)和新城疫(Newcastle disease, ND)提供参考。首先,本文构建了ii-key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位(aa197-209)和新城疫病毒HN肽表位(aa345-353)的嵌合体,并将嵌合体基因插入pET-32a原核表达载体,转化*** Rosetta通过IPTG诱导表达,用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫SPF级BALb/c小鼠,分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明,与VP2/HN串联表位对照组相比较,ii-key/VP2/HN嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。其次,将PEP-1和PEP-1-ii-key串联载体分别与VP2/HN表位连接构建嵌合体(PEP-1/VP2/HN和PEP-1-ii-key/VP2/HN),通过原核表达,融合蛋白的纯化,小鼠免疫和间接-ELISA检测抗体效价等方法,研究PEP-1和PEP-1-ii-key联合载体对VP2/HN串联肽免疫效应的影响。结果表明,与单纯VP2/HN串联肽组相比,均能有效刺激机体产生抗体(8.6和6.7倍,pii-key联合载体免疫增强效应明显低于ii-key载体组(pii-key免疫增强效应发挥负向调控作用。为了探究ii-key和PEP-1免疫增效作用是否与MHCⅡ类分子相互作用的加强有关,本文在构建的原核重组质粒基础上,构建了真核表达载体pmCherry-C 1与VP2/HN、ii-key/VP2/HN、PEP-1/VP2/HN、PEP-1/ii-key/VP2/HN真核重组质粒,与实验室保存的pEGFP-N1-MHCⅡα真核重组质粒转化大肠杆菌DH5a,使用无内毒质粒抽提试剂盒抽提后取适量重组质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染293T细胞,转染24h后使用激光共聚焦显微镜下观察定位情况。结果表明,各处理组均能在胞内与MHCⅡ类分子发生共定位,但是各组间差异不明显。表明ii-key和PEP-1免疫增效作用与其是否增加了VP2/HN表位肽与MHCⅡ的相互作用没有明显关联。综上所述,本文成功构建了VP2/HN与ii-key或PEP-1嵌合体,发现单个载体均能有效增强异种病毒串联抗原表位的体液免疫应答水平,但是PEP-1与ii-key联合使用时,则降低了ii-key免疫增效作用,相关机制有待于进一步研究。此研究结果为构建基于恒定链关键基团ii-key的新型疫苗提供参考。

关键词： ii-key PEP-1 异种病毒抗原表位疫苗免疫效应

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