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中华实验和临床病毒学杂志 2004年第2期18卷 105-108,F002页

作者：郭瑜梁米芳毕胜利中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肝炎室北京100052

目的　研制人源化抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的igg全抗体。方法　采用噬菌体抗体库技术 ,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库 ,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体 ;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体p... 详细信息

目的　研制人源化抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的igg全抗体。方法　采用噬菌体抗体库技术 ,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库 ,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体 ;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体pAc κ Fc中 ,转染SF9细胞表达igg全抗体并进行纯化。免疫荧光检测抗体的表达 ,竞争抑制ELISA检测其与抗原的结合活性及特异性。结果　获得了一株抗乙肝表面抗原的Fab抗体 ;在转染后的SF9培养上清中收获到了igg抗体 ,竞争ELISA证实该抗体针对HBV表面抗原的特异性抗体。结论　本实验得到了一株人源抗HBsAg的igg抗体 ,并进行了纯化。

关键词：乙型肝炎病毒基因工程人源重组抗体 igg全抗体检测

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人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

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免疫学杂志 2012年第4期28卷 312-316页

作者：龚斌李川梁米芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 广西钦州学院海洋学院 535000

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶... 详细信息

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光（IFA）和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体igg蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光（IFA）鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体蛋白。

关键词：杆状病毒/昆虫表达系统人干扰素α1b igg全抗体表达纯化

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抗Aβ鼠源单克隆抗体的人源化改造及其表达鉴定

抗Aβ鼠源单克隆抗体的人源化改造及其表达鉴定

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作者：李彦玮中国协和医科大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种以老年人记忆力减退和认知功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑(senile plaque, SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经突触减少或神经元丢失是AD的... 详细信息

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种以老年人记忆力减退和认知功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑(senile plaque, SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经突触减少或神经元丢失是AD的主要病理特征。其中老年斑的主要成分是p-淀粉样多肽(beta-amyloid peptide, Aβ)聚集形成的纤维,而Ap纤维被认为是导致神经元损伤及认知功能障碍的主要致病物质。阻止Ap多肽聚集及清除大脑病变区已形成的Ap多肽可能成为AD治疗的突破口。已有动物实验证实抗Ap抗体可清除转基因鼠大脑中的Ap多肽,改善痴呆行为。但是,现有的实验都是用的鼠源性抗体,进一步的研究需要将鼠源抗体进行人源化改造后才能应用于人体。本课题是在前期已构建的抗Ap人-鼠嵌合抗体基础上,进一步对嵌合抗体基因进行人源化改造。采用模板替换法对已构建的人-鼠嵌合抗体基因中的重、轻链可变区框架区(Frame region, FR)进行人源化改造。首先从GenBank中找出与抗Ap嵌合抗体高度同源的人源抗体FR基因序列,重链选择GI7846573MBAE45451、轻链选择GI8025598BAK94808,将嵌合抗体的CDR与选定的FR重组,再将重链可变区与人igg恒定区基因连接,构成重、轻链全长基因。重、轻链全长基因分别连入pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(zeo)表达载体后,构建抗Aβ人源化抗体的重组质粒,重链基因全长为1500bp,轻链基因全长700bp。PCR及测序结果均显示,抗Aβ人源化抗体重、轻链基因片段大小、序列与预期一致。大提质粒,采用脂质体法将抗Ap人源化抗体重、轻链重组质粒共转染CHO细胞进行表达。以嵌合抗体重、轻链重组质粒共转染CHO细胞作为阳性对照。ELISA检测结果显示人源化抗体重组质粒能够在CHO细胞中表达,且效价与嵌合抗体基本保持一致。采用ELISA双抗体夹心法检测人源化抗体及嵌合抗体表达量,结果显示人源化抗体在CHO细胞的表达量约为1.1lmg／L,人-鼠嵌合抗体在CHO细胞的表达量约为1.38mg／L。同时,ELISA结果显示,羊抗人抗体分别能与人igg和人源化抗体表达产物样品结合,而羊抗鼠抗体只能与鼠igg结合,而不能与人源化抗体表达产物样品结合,显示人源化抗体表达产物不再具备鼠igg的抗原特性,而具备人igg的抗原特性。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,人源化抗体重链和轻链分子量分别为51ku、25ku。同时,AD小鼠脑切片的免疫组化结果显示,加有人源化抗体表达产物的切片上显示出典型的淀粉样蛋白沉积斑,而正常鼠血清对照组则显示阴性结果,表明人源化抗体表达产物作为抗Aβ抗体能与AD鼠脑切片中淀粉样斑块结合,具有抗体的生物学活性。抗Aβ抗体及人源化改造目前国内外都处于研究阶段,本研究获得人源化的抗体,为进一步开展对AD的免疫治疗研究及应用提供了可能性。

关键词：阿尔茨海默病 β-淀粉样多肽嵌合抗体人源化抗体 igg全抗体真核表达

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抗Aβ人源单链抗体基因的筛选和全抗体基因的构建及表达研究

抗Aβ人源单链抗体基因的筛选和全抗体基因的构建及表达研究

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作者：贾静中国协和医科大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种以老年人中进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑(senile plaque,SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和神经突触减少或神经元丢失是AD的... 详细信息

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种以老年人中进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑(senile plaque,SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和神经突触减少或神经元丢失是AD的主要病理特征。其中老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(beta-amyloidpeptide,Aβ)聚集形成的纤维,而Aβ纤维被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质。针对Aβ多肽在发病中的关键作用,研究如何阻止Aβ多肽聚集及清除大脑病变区已形成的Aβ多肽纤维已成为研究AD治疗的前沿领域,抗Aβ多肽抗体治疗AD也成为AD研究中的一个热点。动物试验已证明抗Aβ多肽抗体有清除小鼠大脑中Aβ纤维斑块防治AD的作用,但至今尚未见人源化抗体有临床应用的报道。本课题研究从人源噬菌体单链抗体库中筛选针对Aβ的单链抗体可变区(scFv)基因,并以基因工程构建人源抗Aβ全抗体的真核表达体系。主要包括两部分:第一,从构建的人源噬菌体单链抗体库中筛选抗Aβ的scFv基因,在原核细胞中进行可溶性表达,并进行抗体结合活性和生物学活性检测;第二,重组igg全抗体轻重链基因及全抗体单链基因,构建真核表达体系,进行真核细胞表达的初步研究。一、抗Aβ人源scFv基因的筛选、原核表达与鉴定以Aβ1-42多肽为抗原对抗体库进行4轮富集筛选:用辅助噬菌体M13K07感染*** TG1转化菌,展示出噬菌体形式的抗体库。将此抗体库加入到用Aβ1-42多肽包被的96孔板内,孵育一段时间后洗涤,能够与抗原特异结合的scFv噬菌体克隆将被保留在96孔板内壁,然后用pH 2.2的甘氨酸-HCl缓冲液将特异结合的噬菌体洗脱下来,经pH8.0的Tris-HCl中和后,感染处于对数生长期的*** TG1,以扩增抗原特异性噬菌体克隆。这样,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集过程,抗体库中与Aβ1-42多肽特异性结合的噬菌体克隆从第1轮的3.31×10增加到第4轮的7.65×10,得到了高度富集,多克隆噬菌体Elisa检测也显示了明确的富集效果。随机挑取80个克隆,用M13K07感染后使scFv展示于噬菌体颗粒表面,ELISA筛选展示有抗Aβ1-42多肽scFv的噬菌体克隆。检测结果显示,得到7个阳性克隆,其中4个克隆ELISA检测A值高于阴性对照5倍以上,另外3个在2.5～3倍之间。所有阳性克隆均与无关抗原BSA无交叉反应。对其中A值最高的2个克隆(A10、F2)的噬菌体颗粒上清感染*** HB2151,30℃,IPTG诱导表达20h,分别制备胞周质、培养基上清和全细胞提取物。经12%SDS-PAGE和western blot分析,目的蛋白相对分子量为33kD,主要集中于全细胞提取物,表达量占全菌蛋白60%左右。表达抗体ELISA检测上清中和全菌蛋白中A值分别高于阴性对照5倍以上,在胞周质中高于2倍以上。抗体与Aβ1-40也有结合反应,但与BSA无交叉反应,显示scFv抗体对Aβ具有特异性,结合位点主要在Aβ的N端。表达抗体的生物学活性鉴定示,可与人脑病变组织内淀粉样斑块中的抗原物质Aβ纤维结合,证明表达的scFv抗体可以应用于体内生物学效应实验。将A10、F2克隆菌测序,用blast分析得到的scFv基因序列,从中分别确定了VH与VL的DNA序列,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。2个克隆的基因序列一致,表明2个克隆菌可能来源于同一株原始噬菌粒。二、抗Aβ人源全抗体基因的重组构建、真核表达研究首先对前期获得的A10克隆scFv基因进行NCBI blast比对,获得VH和VL基因相应的成熟信号肽基因,并合成信号肽基因,再设计特异引物分别扩增A10克隆的VH、VL、scFv基因和人源igg的CH、CL、FC段基因,并利用重组PCR(overlap PCR)方法重组igg全抗体重链基因(H信号肽基因+VH基因+CH基因)、igg全抗体轻链基因(L信号肽基因+VL基因+CL基因)和全抗体单链基因(H信号肽基因+scFv基因+FC段基因),然后分别克隆到pcDNA3.1真核表达载体内。菌液PCR、双酶切鉴定和DNA测序结果均显示,重组的三种基因片段大小与预期一致,基因序列与预期的序列完全一致,读码框架和插入真核表达载体的方向完全正确。将igg全抗体重链基因-载体质粒和igg全抗体轻链基因-载体质粒共转染CHO细胞,表达igg全抗体;将全抗体单链基因-载体质粒转染CHO细胞,表达单链全抗体(scFv抗体+FC段)。两种转染细胞初步的表达产物ELISA结果未见表达上清与Aβ1-42有阳性反应,后续工作仍需优化细胞表达条件。现有的工作进展为今后进一步优化表达、动物试验及应

关键词：阿尔茨海默病 β-淀粉样多肽噬菌体展示技术单链抗体基因工程 igg全抗体真核表达

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