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基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组全长S2蛋白iga抗体ELISA检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医 2023年第3期50卷 1185-1194页

作者：牟一娇于瑞明张莉萍王永录中农威特生物科技股份有限公司兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

【目的】建立一种猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的iga抗体ELISA检测方法。【方法】以PEDV流行株CH/HNPJ/2017(MF152604.1)为生物材料,通过RT-PCR扩增出S 2基因(2368—4170 bp),并将其插入到原核表达载体pET-24a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,经镍柱纯化。Western blotting验证重组蛋白S2与PEDV阳性血清的反应原性和特异性。将其作为包被抗原,建立一种基于PEDV变异毒株重组全长S2蛋白的iga抗体ELISA方法,用棋盘法确定该方法的最优检测条件,对其敏感性、特异性和重复性进行测定,并初步应用于130份猪血清和40份猪口腔黏液的检测。【结果】通过RT-PCR方法扩增出S 2基因,成功构建重组表达载体pET-24a-S2,转化大肠杆菌经诱导表达纯化后获得重组S2蛋白。SDS-PAGE结果显示,纯化的S2蛋白条带特异且无杂带;Western blotting试验表明该蛋白与PEDV阳性猪血清具有良好的反应性。ELISA方法反应条件优化结果显示,重组S2蛋白的最佳包被条件为每孔0.5μg、4℃过夜包被;血清最佳反应条件为1∶160稀释,37℃孵育60 min;酶标二抗最佳反应条件为1∶5000稀释,37℃反应30 min;TMB最佳显色时间为室温下10 min。待检样品S/P值≥0.04时为阳性,S/P值≤0.02时为阴性,S/P值介于0.02~0.04之间为可疑。利用本试验建立的ELISA方法检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪德尔塔冠状病毒标准阳性血清,S/P值均iga抗体检测试剂盒的符合率为90.77%;该方法对40份猪口腔黏液的检测结果表明,阳性检出率为90.0%,阴性检出率为为93.3%。【结论】本研究成功构建pET-24a-S2重组质粒,获得纯度较高的重组S2蛋白,并以此作为包被蛋白建立了基于全长S2蛋白iga抗体ELISA检测方法。该方法能同时有效检测血清和口腔黏液样本,且敏感性强、特异性高、稳定、重复性好,该方法对PEDV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。

关键词：猪流行性腹泻 S2蛋白 iga抗体 ELISA

COVID-19确诊病例及灭活疫苗接种者不同时期血清iga、IgM、IgG抗体检测结果比较

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中国公共卫生 2023年第9期39卷 1159-1164页

作者：李东晓卢世栋胡晓宋云毋碧聪李亚飞李懿马红霞王海峰叶莹黄学勇河南省疾病预防控制中心郑州450016

目的研究不同时期新型冠状病毒感染(COVID-19)病例及接种2019-nCoV灭活疫苗人群的抗体免疫应答规律及特点。方法于2020年1月—2021年10月采集河南省43例COVID-19确诊病例的86份血清标本,46名灭活疫苗接种者的184份血清标本,50名未感染... 详细信息

目的研究不同时期新型冠状病毒感染(COVID-19)病例及接种2019-nCoV灭活疫苗人群的抗体免疫应答规律及特点。方法于2020年1月—2021年10月采集河南省43例COVID-19确诊病例的86份血清标本,46名灭活疫苗接种者的184份血清标本,50名未感染健康人的50份血清标本,采用磁微粒化学发光法和酶联免疫吸附法对320份血清标本检测并分析其抗体水平。结果确诊病例恢复期iga、IgM、IgG抗体阳性率高于急性期(P值均抗体水平高于急性期(P值均iga抗体阳性率分别维持在63.04%(29/46)和36.96%(17/46),IgM抗体全部转阴;疫苗接种者第4、8、12、31周iga抗体吸光度值差异无统计学意义(F=2.365,P=0.073),IgM、IgG抗体水平差异均有统计学意义(Piga、IgM抗体阳性率高于疫苗接种者,IgM、IgG抗体水平高于疫苗接种者(P值均抗体在新型冠状病毒感染早期和恢复期阳性率最高。iga、IgG抗体出现时间较IgM早,在疫苗接种者体内持续时间超过31周。同时期确诊病例的IgM、IgG抗体水平高于疫苗接种者。

关键词： iga抗体 IgG抗体 IgM抗体血清学检测 COVID-19确诊病例新冠病毒灭活疫苗接种者

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iga抗体的结构、功能与调控

中国实验血液学杂志 1995年第3期3卷 253-259页

作者：王玉奇中国科学院昆明动物研究所昆明650223

iga抗体是介导机体粘膜免疫的主要因子,其在粘膜分泌物中能有效地阻止外界抗原(包括可溶性抗原、病原微生物以及存在于食物中的致癌物质)附着或侵入粘膜上皮,从而避免这些外来物给机体造成损伤,保持机体粘膜完整并避免胃肠道疾病、呼吸... 详细信息

iga抗体是介导机体粘膜免疫的主要因子,其在粘膜分泌物中能有效地阻止外界抗原(包括可溶性抗原、病原微生物以及存在于食物中的致癌物质)附着或侵入粘膜上皮,从而避免这些外来物给机体造成损伤,保持机体粘膜完整并避免胃肠道疾病、呼吸道疾病及泌尿生殖道各种疾病的发生。为了能有效地利用iga抗体的免疫保护功能,解决诸多困扰人类的粘膜性疾病,前人从很多方面对iga抗体做了大量的研究,得到很多有意义的结果。本文试图总结这些研究成果,结合最新的研究进展,对iga抗体的结构、功能及调控等进行评述。

关键词： iga抗体粘膜免疫 B细胞外分泌物霍乱毒素上皮细胞细胞因子粘膜固有层 T细胞抗原复合物

不同厂家PEDV-iga抗体ELISA检测试剂盒的对比分析

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今日养猪业 2023年第5期 80-84页

作者：胡泽奇谭祖明尹爱云王江平龙娉李润成湖南农业大学动物医学院湖南龙华农牧发展有限公司茶陵县畜牧水产事务中心

为比较市面上常用PEDV-iga抗体ELISA试剂盒检测结果之间的相关性,挑选不同厂家生产的3款试剂盒检测了68份母猪初乳及78份免疫前后的后备母猪血清,并对检测结果进行了相关性分析。结果表明:不同试剂盒检测初乳和血清PEDV-iga抗体结果差... 详细信息

为比较市面上常用PEDV-iga抗体ELISA试剂盒检测结果之间的相关性,挑选不同厂家生产的3款试剂盒检测了68份母猪初乳及78份免疫前后的后备母猪血清,并对检测结果进行了相关性分析。结果表明:不同试剂盒检测初乳和血清PEDV-iga抗体结果差异较大,在进行实验室检测时,应注意合理选择试剂盒,并科学地分析和利用实验室检测结果。

关键词：后备母猪 ELISA试剂盒 ELISA检测试剂盒 PEDV iga抗体实验室检测试剂盒检测初乳

猪流行性腹泻病毒iga抗体间接ELISA方法的建立

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中国预防兽医学报 2019年第9期41卷 918-923页

作者：刘烨张家林王潇博石达时洪艳陈建飞张鑫冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性iga抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT... 详细信息

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性iga抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白。以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪iga-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性iga抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验。特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%。本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性iga抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段。

关键词： PEDV 间接ELISA S1蛋白 iga抗体

寨卡病毒感染者血液、尿液和唾液中iga抗体水平初步研究

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病毒学报 2018年第3期34卷 304-309页

作者：芜为张全福李阿茜李川李建东梁米芳李德新中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

为研究寨卡病毒（ZIKV）感染者血清、尿液和唾液样本中特异性iga抗体水平,进一步了解ZIKV感染免疫机制,本研究重组表达制备寨卡病毒NS1蛋白,对其浓度、纯度进行鉴定,初步评估了NS1蛋白抗原性,并建立间接酶联免疫（Indirect-ELISA）方法... 详细信息

为研究寨卡病毒（ZIKV）感染者血清、尿液和唾液样本中特异性iga抗体水平,进一步了解ZIKV感染免疫机制,本研究重组表达制备寨卡病毒NS1蛋白,对其浓度、纯度进行鉴定,初步评估了NS1蛋白抗原性,并建立间接酶联免疫（Indirect-ELISA）方法,检测患者临床血清、尿液和唾液样本中的寨卡特异性iga抗体。利用健康人群血清、尿液和唾液标本,评估检测方法的特异性,并确定以阴性对照的均值加3倍标准差作为判定检测结果的阈值,特异性为100%。对经病毒核酸检测所确诊病例的33份血清样本、4份尿液样本和3份唾液样本进行检测。选择3份具有较高iga抗体水平的血清,通过2倍系列稀释的方法评价了血清样本中特异性iga抗体的滴度,可有效检出经3 200倍以上稀释的血清样本中的iga抗体。重复性检测实验显示板间变异系数为（3.0±0.8）%,板内变异系数为（2.7±1.0）%。寨卡患者血清、尿液和唾液样本中的特异性iga抗体的检出率分别为75.8%（25/33）、100%（4/4）和33.3%（1/3）,提示iga抗体在3种体液标本中均具有显著的存在,具有充当体外诊断指标的意义。同时尿液、唾液标本中特异性iga抗体的存在,提示潜在的粘膜免疫效应,有助于增强对病毒体内播散和体外传播的理解,也初步提示了寨卡病毒NS1蛋白可用于相关免疫学诊断试剂的研发。

关键词：寨卡病毒(ZIKV) 间接法ELISA iga抗体

血清肺炎衣原体iga抗体水平与缺血性脑卒中关系的研究

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中国实用内科杂志 2007年第4期27卷 296-299页

作者：周波时景璞付凌雨李若白曹晓红杨志齐李辉中国医科大学附属第一医院临床流行病教研室辽宁沈阳110001 中国医科大学社科部卫生管理教研室辽宁沈阳110001 北票市中小学卫生保健所体检科辽宁北票122100

目的探讨血清肺炎衣原体iga抗体水平与缺血性脑卒中发生的关系。方法采用病例对照研究的方法,对2002年10月至2004年7月中国医科大学附属第一医院临床流行病学教研室从彰武县农村调查发现的符合入选标准的117例缺血性脑卒中患者中随机抽... 详细信息

目的探讨血清肺炎衣原体iga抗体水平与缺血性脑卒中发生的关系。方法采用病例对照研究的方法,对2002年10月至2004年7月中国医科大学附属第一医院临床流行病学教研室从彰武县农村调查发现的符合入选标准的117例缺血性脑卒中患者中随机抽取76例作为病例组,同时从该调查人群中选取80例与病例组相匹配的无脑卒中史者作为对照组,每人采血5mL,采用EIA试剂盒进行血清肺炎衣原体iga抗体的检测。结果(1)病例组与对照组肺炎衣原体iga抗体EIU均值分别为45.56±40.95和48.75±40.72,差异无显著性(P>0.05)。(2)病例组与对照组肺炎衣原体iga抗体阳性率分别为72.4%和75.0%,两组间差异无显著性(P>0.05),优势比OR=0.873(95%可信区间0.428～1.782)。(3)对缺血性脑卒中发生及其危险因素的多元Logistic回归分析,得到的调整iga抗体阳性率与缺血性脑卒中的关系仍无显著性意义。结论肺炎衣原体抗体与缺血性脑卒中发生可能无关联。

关键词：缺血性脑卒中肺炎衣原体 iga抗体

血清阴性脊椎关节病患者肠活检样本中的耶氏菌与血清中特异性iga抗体的相互关系

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地方病译丛 1990年第4期11卷 18-21页

作者：岑衍华

血清阴性的脊椎关节病的病人有许多共同的临床特征,诸如:脊椎炎,骶骨关节炎,末稍关节炎,缺乏类风湿因子和组织相容性抗原 B-27(HLA-B-27)的流行率高等。在肠或生殖器感染后,这些脊椎关节病定义为反应性关节炎。

关键词：脊椎关节病耶氏菌 iga抗体

猪流行性腹泻病毒IgG、iga抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

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猪流行性腹泻病毒IgG、IgA抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

作者：芮聪杰安徽农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、水样腹泻和脱水为主要症状的急性、高度接触性肠道传染病。自2010年秋以来,PEDV在全国大范围的流行,给我国养... 详细信息

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、水样腹泻和脱水为主要症状的急性、高度接触性肠道传染病。自2010年秋以来,PEDV在全国大范围的流行,给我国养猪业带来了巨大的经济损失,对于PEDV的预防,目前主要还是以疫苗免疫为主,然而由于各个养殖场疫苗接种方法的不同、疫苗质量的差异等原因,虽然接种了 PED疫苗,但接种后抗体水平往往参差不齐,因此对于PED疫苗免疫后抗体水平的检测尤为重要。本试验分别以纯化后的PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立了能够检测母猪初乳中PEDV iga抗体和猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法,本研究的内容包括以下部分:1)PEDV纯化全病毒抗原和重组N蛋白抗原的制备首先,将实验室制备保存的pET-28B-N重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析初步确定重组蛋白得到了可溶性表达,诱导条件为15℃下加入0.5 mmol/L的IPTG诱导24h,蛋白表达量最高,经BCA法测得重组N蛋白的浓度为1.23 mg/mL,表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PEDV标准阳性血清发生特异性反应。其次,收集PEDV细胞培养液,加入10%体积的Triton X-100进行处理后,采用超速离心法对其进行纯化,获得PEDV全病毒抗原,经BCA法测得浓度为3.95 mg/mL。2)检测母猪初乳中PEDV iga抗体的间接ELISA方法的建立分别以纯化PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立检测母猪初乳中PEDV iga抗体的间接ELISA方法,对各项反应条件进行优化,抗原最佳包被浓度为:PEDV全病毒抗原和重组N蛋白均为2 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉37℃封闭2h,乳汁样品最佳稀释倍分别为1:30和1:10,37℃反应60min;羊抗猪iga-HRP工作浓度为1:10000,37℃反应60min:TMB 37℃反应15min。两个方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒阳性样品均为阴性,两个方法的重复性变异系数均小于10%,与BIONNTE公司商品化试剂盒比较,符合率分别为92.31%和88.46%,证明两种方法均具有较好的特异性、重复性及较高符合率,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。3)检测血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法的建立分别以纯化PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法,对各项反应条件进行优化,抗原最佳包被浓度为:PEDV全病毒抗原为1μg/mL,重组N蛋白为4.92μg/mL,血清样品最佳稀释倍数分别为1:100和1:50,37℃反应60min;羊抗猪IgG-HRP工作浓度为1:5000,反应时间分别为37℃反应60min和37℃反应30min;TMB 37℃反应15min;两个方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒阳性样品均为阴性,两个方法的重复性变异系数均小于10%,最低检测限分别为1:1600和1:800,证明两种方法均可以为PEDV诊断和流行病学调查提供依据。综上所述,本研究利用PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,成功建立了间接ELISA抗体检测方法,为PEDV血清学诊断、免疫抗体检测及免疫学调查提供了简便、快速的检测手段。也为后续试剂盒的研发打下基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒重组N蛋白 IgG抗体 iga抗体间接ELISA