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重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的抗HBV机制

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中国药理学通报 2010年第2期26卷 274-275页

作者：徐丙发范鲁雁范清林魏伟宋礼华安徽医科大学临床药理研究所·抗炎免疫药理学省部共建教育部重点实验室安徽合肥230032 安徽医科大学第三附属医院合肥市第一人民医院安徽合肥230061 安徽安科生物工程(集团)有限公司安徽省生物研究所安徽合肥230088

IFN-α是目前临床上常用的抗HBV药物,但普通IFN-α半衰期只有4～6 h,患者不得不接受频繁的皮下注射,疗程至少半年.重组人白蛋白融合干扰素α-2b(rHSA-IFNα-2b)是通过生物工程技术,构建编码人血清白蛋白(HSA)和IFNα-2b的融合基因并在... 详细信息

IFN-α是目前临床上常用的抗HBV药物,但普通IFN-α半衰期只有4～6 h,患者不得不接受频繁的皮下注射,疗程至少半年.重组人白蛋白融合干扰素α-2b(rHSA-IFNα-2b)是通过生物工程技术,构建编码人血清白蛋白(HSA)和IFNα-2b的融合基因并在载体中获得高效表达而成的一种长效干扰素~([1]).本研究以HepG2 2.2.15细胞为模型,对rHSA-IFNα-2b的体外抗HBV作用进行了研究,为rHSA-IFNα-2b用于临床治疗慢性乙型肝炎提供实验依据.

关键词： rHSA—IFNα-2b 乙肝病毒 STAT1 isgf3 2'-5’-OAS

猪流行性腹泻病毒nsp7抑制Ⅰ型IFN信号转导机制研究

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猪流行性腹泻病毒nsp7抑制Ⅰ型IFN信号转导机制研究

作者：袁双玲华中农业大学

学位级别：硕士

由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪腹泻给世界养猪业造成了巨大的经济损失,该病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、甲型冠状病毒属,基因组为单股正链RNA,大小约28kb,共编码16个非结构蛋白(nsp1sp16),4个... 详细信息

由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪腹泻给世界养猪业造成了巨大的经济损失,该病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、甲型冠状病毒属,基因组为单股正链RNA,大小约28kb,共编码16个非结构蛋白(nsp1sp16),4个结构蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)及一个辅助蛋白ORF3。在病毒的感染过程中,宿主细胞能够产生多种抵抗病毒入侵的分子,包括干扰素(Interferon,IFN),促炎性细胞因子以及趋化因子等。干扰素及其诱导的干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)是宿主抗病毒感染的重要防御机制,但病毒往往进化出各种策略拮抗宿主干扰素的抗病毒作用,从而达到感染宿主并致病的目的。已有研究证实PEDV具有抑制Ⅰ型IFN产生和信号转导的能力,但对其编码的nsp7蛋白在其中的作用尚不清楚。鉴于此,本论文以PEDV nsp7为研究对象,开展了以下研究:*** nsp7抑制ISRE启动子活化和ISGs的产生PEDV可以感染不同年龄段的猪,因此其免疫逃逸策略的研究十分值得我们关注。而许多病毒拮抗IFN的免疫应答多是凭借其编码产生的蛋白实现的。因此,本研究筛选了参与抑制ISRE启动子活化的PEDV编码蛋白,结果显示,nsp7能够显著抑制IFN-α介导的ISRE启动子活化,且其抑制效果呈明显的剂量依赖性。同时,荧光定量PCR实验证实PEDV nsp7能够显著抑制ISG15、ISG54及ISG56在mRNA水平上的表达。*** nsp7不影响JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2磷酸化和isgf3的形成许多病毒在进化过程中形成多种策略来扰乱Ⅰ型IFN的信号转导。Western blot实验显示,PEDV nsp7不影响JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2的蛋白表达以及磷酸化水平,同时对STAT1/STAT2/IRF9三者组成的复合物isgf3的形成也没有影响,但是可以显著抑制isgf3复合物诱导的ISRE启动子活化,并且与isgf3间存在相互作用。isgf3的入核是ISGs产生的必须环节。PEDV nsp7不影响STAT1、STAT2的表达与磷酸化及isgf3复合物的形成,但却抑制isgf3诱导的ISRE启动子活性,那么它是否会影响STAT1、STAT2的入核呢?我们分别进行间接免疫荧光实验和胞质胞核分离实验进行检测,结果显示,PEDV nsp7能够显著抑制STAT1、STAT2、IRF9的核转运。*** nsp7与KPNA1竞争性结合STAT1,阻碍isgf3核转运由于PEDV nsp7明显地抑制STAT1、STAT2、IRF9的入核,且PEDV nsp7与isgf3复合物存在相互作用,推测PEDV nsp7的抑制效果可能是通过与STAT1、STAT2或IRF9相互作用实现的。通过免疫共沉淀实验我们得出结论,PEDV nsp7与IRF9间不存在相互作用,但可与STAT1、STAT2发生互作,且特异性结合STAT2的DBD结构域,此结构域在STATs蛋白家族中同源性较高,存在非典型的NLS序列,是isgf3复合物被核转运蛋白KPNA1识别的关键氨基酸序列。鉴于此,我们利用CO-IP实验检测nsp7是否影响KPNA1与STAT1的结合。结果表明,随着nsp7转染量的增加,KPNA1与STAT1间的互作逐步减弱,因此,PEDV nsp7通过与KPNA1竞争性结合STAT1,抑制KPNA1对STAT1的识别,从而特异性阻碍了isgf3核转运。*** nsp7负调控Ⅰ型IFN信号转导与nsp8无关已有研究表明,猫冠状病毒nsp7/nsp8复合物晶体结构呈现2:1的异源三聚体形式,与nsp7的结合可增强nsp8的RNA聚合酶活性;SARS冠状病毒中nsp7/nsp8以8:8的形式组成十六聚体,能够显著增强nsp8具有的RdRp活性且具有引物延伸能力。那么,nsp7对JAK-STAT信号通路的抑制作用是否与nsp8相关呢?我们将nsp7、nsp8单独转染或者以不同比例共转染于HEK-293T细胞,收样后利用双荧光素酶报告系统进行分析,结果显示nsp8本身不诱导ISRE启动子活化,且nsp7对ISRE启动子活性的抑制作用不依赖于nsp8。

关键词：猪流行性腹泻病毒 nsp7 Ⅰ型干扰素 isgf3 KPNA1

SAMHD1抗乙肝病毒作用及IFN-α调控SAMHD1表达的机制研究

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SAMHD1抗乙肝病毒作用及IFN-α调控SAMHD1表达的机制研究

作者：朱梦萦安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景及目的SAMHD1(the sterile alpha motif and HD domain containing protein-1)2011年被发现是一个新的固有免疫抗病毒分子。SAMHD1通过降解宿主细胞内d NTPs至低水平使逆转录病毒c DNA不能合成进而抑制病毒复制。研究表明SAMHD... 详细信息

研究背景及目的SAMHD1(the sterile alpha motif and HD domain containing protein-1)2011年被发现是一个新的固有免疫抗病毒分子。SAMHD1通过降解宿主细胞内d NTPs至低水平使逆转录病毒c DNA不能合成进而抑制病毒复制。研究表明SAMHD1可以抑制逆转录病毒、DNA病毒的复制和内源性逆转录因子的逆转录转座。而Ⅱ型艾滋病病毒(HIV-2)和猴免疫缺陷病毒(SIVsm/mac)辅助基因编码的Vpx蛋白则能拮抗SAMHD1对病毒复制的抑制作用。乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是全球性的公共健康问题。我们国家是乙肝病毒感染高度流行的国家。乙肝病毒的生命周期过程中有一个与慢病毒类似的逆转录过程,然而SAMHD1是否可以在肝细胞中通过降解d NTPs来抑制HBV的复制尚不清楚。干扰素(Interferon,IFN)作为乙肝治疗中一种常用的抗病毒药物,可以诱导许多抗病毒蛋白表达从而抑制病毒的复制。IFN-α可以通过经典途径和非经典途径诱导基因表达。经典IFN-α信号通路通过干扰素刺激基因因子3(isgf3)诱导基因表达。isgf3包括STAT1、STAT2和IRF9。非经典信号通路是STAT1非依赖的。至今,IFN-α在肝细胞中调控SAMHD1表达的机制尚不明确。本研究将探讨SAMHD1对HBV复制的影响及IFN-α以何种途径诱导肝细胞中SAMHD1表达。方法选取肝细胞系Hep G2、LO2、BEL-7402和SMMC-7721,使用Western Blot检测SAMHD1内源性表达水平,并用免疫荧光法验证。选择两株低表达SAMHD1的肝细胞BEL-7402和SMMC-7721,分别转染p SAMHD1wt和p SAMHD1HD/AA,MTT检测细胞的活性率。p HBVwt分别与p SAMHD1wt或p SAMHD1HD/AA瞬时转染入SMMC-7721和BEL-7402细胞,Western Blot检测SAMHD1外源性表达情况。p HBVwt,p RL-TK分别与p SAMHD1wt或p SAMHD1 HD/AA共转染SMMC-7721和BEL-7402细胞,48 h后,ELISA检测细胞上清HBs Ag、HBe Ag含量,q RT-PCR检测HBV核心相关DNA的水平。Hep G2细胞转染p HBVwt和p HBV△X质粒,Western Blot检测SAMHD1蛋白表达水平。选取SMMC-7721和BEL-7402细胞,IFN-α以不同剂量和时间点处理肝细胞后,Western Blot和q RT-PCR检测SAMHD1表达改变情况。选取IFN-α诱导的SMMC-7721细胞,分别转染STAT1、STAT2和IRF9 si RNA下调相应基因表达后,再用IFN-α刺激,Western Blot和q RT-PCR检测IFN-α诱导SAMHD1表达是否受到抑制。结果在四株肝细胞系Hep G2、LO2、BEL-7402和SMMC-7721中,检测到SAMHD1均有内源性表达;SAMHD1的外源性表达对肝细胞系无细胞毒作用;肝细胞SMMC-7721、BEL-7402中SAMHD1可以抑制HBV的复制;Hep G2细胞中HBV复制可以下调SAMHD1表达;在肝细胞SMMC-7721、BEL-7402中IFN-α以时间和剂量依赖的方式上调SAMHD1蛋白表达水平;IFN-α处理的SMMC-7721细胞以时间依赖的方式在m RNA水平上调SAMHD1表达;分别用特异性si RNAs下调STAT1、STAT2和IRF9基因表达后,SMMC-7721细胞中再加入IFN-α刺激10 h,IFN-α诱导的SAMHD1表达水平下降。结论***1在肝细胞内可以抑制HBV复制;***-α在肝细胞中可以诱导SAMHD1表达;***-α在SMMC-7721中通过isgf3复合体诱导SAMHD1表达。

关键词： SAMHD1 HBV IFN-α 肝细胞 isgf3

猪圆环病毒2型Rep蛋白逃逸Ⅰ型干扰素介导抗病毒反应的机制研究

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猪圆环病毒2型Rep蛋白逃逸Ⅰ型干扰素介导抗病毒反应的机制研究

作者：邱思语南京农业大学

学位级别：硕士

天然免疫系统是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道屏障,而其中Ⅰ型干扰素介导的抗病毒反应在宿主建立抗病毒过程中发挥着重要作用。当宿主细胞被病毒入侵时,宿主将会通过细胞的模式识别受体(PRRs)识别入侵病原微生物的病原体相关分子模式(... 详细信息

天然免疫系统是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道屏障,而其中Ⅰ型干扰素介导的抗病毒反应在宿主建立抗病毒过程中发挥着重要作用。当宿主细胞被病毒入侵时,宿主将会通过细胞的模式识别受体(PRRs)识别入侵病原微生物的病原体相关分子模式(PAMPs),受体相关的信号通路被激活使信号级联放大,最终诱导细胞产生并分泌Ⅰ型干扰素。细胞表面的干扰素受体IFNAR1和IFNAR2将识别分泌至胞外的Ⅰ型干扰素并与之结合,激活胞内的酪氨酸激酶JAK1和TYK2,随后受体招募信号转导与转录激活因子STAT1和STAT2并由活化的酪氨酸激酶使其发生磷酸化,两者进而组成异源二聚体复合物再与干扰素调节因子IRF9结合从而形成干扰素刺激基因因子3(isgf3),isgf3复合物入核后与干扰素刺激应答元件(ISRE)启动子结合,诱导大量的抗病毒蛋白产生,最终使宿主建立抗病毒状态。与此同时许多病毒为了保证自身复制也进化出多种逃逸Ⅰ型干扰素介导的抗病毒反应的策略。已有研究表明,当JAK-STAT信号通路被其特异性抑制剂AG490抑制时,能够促进PCV2在PK-15细胞中的增殖,但PCV2自身是否能逃逸Ⅰ型干扰素介导的抗病毒反应及其具体机制还未见报道。鉴于此我们筛选了 PCV2的主要编码蛋白并探究其在JAK-STAT信号通路中的作用,进一步揭示PCV2致病性与宿主天然免疫间的分子机制。在本研究中,我们首先用PCV2感染PK-15细胞并加入IFN-α刺激后,通过荧光定量PCR确定PCV2能显著抑制Ⅰ型干扰素介导的抗病毒反应。接下来构建了 6个PCV2编码蛋白的过表达质粒,将PCV2 ORF 1～6编码蛋白分别转染293T细胞并加入IFN-α刺激,采用双荧光素酶报告基因检测系统和荧光定量PCR方法筛选出PCV2 ORF1编码的Rep蛋白能显著降低由IFN-α诱导的ISRE启动子活性(P3T细胞和PK-15细胞并加入IFN-α刺激,Westen Blotting结果表明过表达Rep不影响JAK-STAT通路中关键接头蛋白JAKs、STATs及IRF9的表达及磷酸化水平。将Rep与isgf3复合物组分(STAT1、STAT2、IRF9)过表达质粒共转染293T细胞,通过荧光定量PCR确定Rep能抑制由isgf3诱导的抗病毒蛋白ISG54和ISG56的mRNA表达(Pisgf3或其下游抑制抗病毒蛋白产生。将Rep与STAT1、STAT2、IRF9过表达质粒共转染293T细胞并加入IFN-α刺激,免疫共沉淀实验结果表明Rep不会影响isgf3复合物的形成。然后将Rep过表达质粒转染293T细胞并加入IFN-α刺激,分别提取细胞核蛋白和细胞质蛋白样品。核质分离实验结果表明Rep会抑制isgf3复合物向细胞核转运,表明PCV2 Rep影响isgf3复合物的入核过程从而抑制干扰素下游信号通路。isgf3复合物的核转运主要由核转运蛋白KPNA1介导,将Rep与KPNA1过表达质粒共转染293T细胞并加入IFN-α刺激,通过免疫共沉淀实验发现Rep与KPNA1存在相互作用,并且抑制KPNA1和isgf3复合物中p-STAT1的结合,表明PCV2 Rep通过靶向KPNA1从而抑制isgf3复合物入核进而抑制抗病毒蛋白产生。核转运蛋白介导胞质中含有核定位序列(NLS)的待转运蛋白进行核转运,通过cNLS Mapper软件预测出PCV2 Rep中8RSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIR33这段NLS序列的入核活性最高。为了探究Rep NLS是否为影响p-STAT1与KPNA1之间结合的关键序列,在Rep过表达质粒的基础上构建缺失NLS的RepΔNLS突变表达质粒。将Rep或RepΔNLS与KPNA1、STAT1过表达质粒共转染293T细胞并加入IFN-α刺激,免疫共沉淀实验表明RepΔNLS抑制KPNA1与p-STAT1结合的能力明显弱于Rep。将Rep或RepΔNLS过表达质粒分别转染293T细胞并加入IFN-α刺激,荧光定量PCR结果也表明,RepΔNLS与Rep相比明显增加了 ISG54和ISG56 mRNA表达(Pisgf3复合物入核最终抑制ISGs的产生,并且核定位序列NLS在Rep抑制抗病毒蛋白产生过程中发挥着重要作用。

关键词： PCV2 Rep蛋白 Ⅰ型干扰素 KPNA1 isgf3

PRRSV nsp11抑制Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究

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PRRSV nsp11抑制Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究

作者：蔚超亮华中农业大学

学位级别：硕士

天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线,其中Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β等)在抗病毒过程中扮演着重要作用。当病毒入侵到宿主细胞后,病毒的病原相关分子模式(PAMPs)将被宿主细胞的模式识别受体(PRRs)识别,进而活化下游信号分子... 详细信息

天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线,其中Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β等)在抗病毒过程中扮演着重要作用。当病毒入侵到宿主细胞后,病毒的病原相关分子模式(PAMPs)将被宿主细胞的模式识别受体(PRRs)识别,进而活化下游信号分子,诱导机体产生Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)并分泌到细胞外。分泌的IFN-α/β将与细胞表面的异源二聚体受体(IFNAR1和IFNAR2)结合,激活胞内两个酪氨酸激酶(JAK1、TYK2)。活化的酪氨酸激酶使下游两个信号转导和转录活化因子(STAT1、STAT2)发生磷酸化,进而形成异源二聚体,然后与干扰素调节因子9(IRF9)形成干扰素刺激基因因子3(isgf3)。isgf3转入细胞核后,结合到干扰素刺激应答元件(ISREs)上,从而诱导数以百计的干扰素刺激基因(ISGs)的转录、翻译,最终为宿主建立起抗病毒状态。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的免疫抑制性疾病,给全球养猪业造成了极大的经济损失。已有研究表明,PRRSV进化出一系列逃避宿主免疫的机制,能通过多种策略拮抗Ⅰ型干扰素的产生。PRRSV编码蛋白nsp1α/1β、nsp2、nsp4、nsp11和N蛋白均能够抑制干扰素的产生。同时,PRRSV也可以抑制Ⅰ型干扰素信号转导,目前只有nsp1β和N蛋白有相关文献报道,然而对其他PRRSV编码蛋白抑制Ⅰ型干扰素信号通路的作用机制还不清楚。PRRSV nsp11具有套式病毒的特异性尿嘧啶核糖核酸内切酶(Nendo U)活性,在病毒复制过程中发挥着重要作用。本研究以PRRSV nsp11为研究对象,探究其在Ⅰ型干扰素信号通路中的作用,并解释其作用机制,主要研究内容如下:*** nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活化和ISGs的表达为了探讨PRRSV nsp11是否具有抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活化和ISGs的表达的能力,我们将nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体(H129A、H144A、K173A)真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,双荧光素酶报告系统和荧光定量PCR检测实验结果表明,nsp11及其突变体都可以抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活化和ISGs的表达。说明nsp11能够抑制Ⅰ型干扰素的信号转导,并且该抑制作用不依赖于nsp11的核糖核酸内切酶活性。为了进一步探究其可能的作用机制,将nsp11以及其突变体(H129A、H144A、K173A)真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,用IFN-α刺激6h。Western blot实验结果显示,PRRSV nsp11及其突变体不影响STAT1、STAT2的磷酸化,也不影响STAT1、STAT2和IRF9的表达。然后将nsp11及其突变体(H129A、K173A)真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,用IFN-α刺激6h后,分别提取细胞质蛋白和细胞核蛋白样品。核质分离实验结果表明,nsp11及其突变体(H129A、K173A)能够抑制isgf3复合体成分p-STAT1、p-STAT2和 IRF9的入核。*** nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体与IRF9存在相互作用STAT1、SATA2、和IRF9在Ⅰ型干扰素信号通路中扮演着重要角色,可以形成ISFG3复合体,入核后将起始ISGs的表达。为了探究nsp11如何抑制isgf3复合体入核,我们通过免疫共沉淀实验检测nsp11是否与isgf3主要成分(STAT1、STAT2和IRF9)存在相互作用。将nsp11或突变体(H129A、H144A和K173A)分别与STAT1、STAT2、IRF9真核表达质粒共转染HEK-293T细胞,免疫共沉淀实验结果表明,nsp11和突变体都能与IRF9发生相互作用。为了进一步鉴定nsp11与IRF9的互作结构域,首先构建了4个IRF9不同区域缺失的截短突变体。将nsp11或H129A真核表达质粒分别与IRF9不同区域缺失的截短突变体真核表达质粒共转染到HEK-293T细胞。免疫共沉淀实验结果表明,nsp11和及其突变体(H129A)与IRF9的IAD结构域存在相互作用。*** nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体抑制isgf3诱导的ISRE启动子活化由于STAT2也与IRF9的IAD结构域存在相互作用,nsp11和STAT2很可能竞争性与IRF9结合。为探究nsp11是否抑制isgf3复合体的形成,将nsp11或突变体(H129A)真核表达质粒分别与isgf3关键分子(STAT1、STAT2和IRF9)的真核表达质粒共转染到HEK-293T细胞,用IFN-α刺激6h。免疫共沉淀实验结果表明,PRRSV nsp11

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp11 isgf3 IRF9