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静原鸡circACLY调控成肌细胞增殖、分化和凋亡的机制研究

静原鸡circACLY调控成肌细胞增殖、分化和凋亡的机制研究

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作者：王卫振宁夏大学

学位级别：硕士

肌苷一磷酸（imp）作为重要的嘌呤核苷酸,它不仅是一种重要的鲜味物质,而且作为嘌呤核苷酸代谢重要产物,它也是生命生存繁衍的基础。研究表明imp从头合成途径影响细胞的增殖和凋亡。imp从头合成途径受多个基因表达和信号传导的影响,而... 详细信息

肌苷一磷酸（imp）作为重要的嘌呤核苷酸,它不仅是一种重要的鲜味物质,而且作为嘌呤核苷酸代谢重要产物,它也是生命生存繁衍的基础。研究表明imp从头合成途径影响细胞的增殖和凋亡。imp从头合成途径受多个基因表达和信号传导的影响,而基因的表达水平也受到多种因子的调控,转录后调控和表观遗传修饰是影响基因表达量水平的重要机制。研究发现非编码RNA（ncRNA）包括 microRNA（miRNA）、环状 RNA（circRNA）和长链非编码 RNA（lncRNA）参与基因的转录后调控,并且越来越多的研究显示这些ncRNA参与骨骼肌的生长发育。静原鸡是国家畜禽保护品种,也是宁夏地区5个畜禽保护品种之一。本研究以静原鸡为试验材料,利用转录组测序（RNA-seq）技术和生物信息学分析筛选影响静原鸡骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的关键circRNA。同时利用过表达试验,敲除试验,实时荧光定量PCR（RT-PCR）,双荧光素酶基因报告系统,RNase R消化试验,亚细胞定位试验,CCK-8试验,EDU试验,酶联免疫吸附（Elisa）试验等对关键circRNA和miRNA进行细胞功能验证。主要研究结果如下:（1）本研究利用RNA-seq技术,鉴定静原鸡肌肉组织中circRNA的表达谱,共鉴定出circRNA 9456个,其中有2111个circRNA在胸肌中鉴定出,2148个circRNA在腿肌中鉴定出的,在胸肌和腿肌中共同鉴定出的circRNA5197个。共筛选出差异表达circRNA 516个,其中188个上调,328个下调。circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析共得到42个差异表达circRNA,6个差异表达miRNA,12个差异表达基因,其中神经颗粒蛋白（NRGN）、丙酮酸激酶2（PKM2）和三磷酸外核苷二磷酸水解酶7（ENTPD7）差异性最大。此外,RT-PCR结果显示,circRNA的测序和定量结果一致,可用于后续circRNA的功能验证。（2）通过发散引物和聚合引物进行PCR扩增以及RNase R的消化试验确定circACLY为来自于ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）基因第2-3外显子的circRNA。对circACLY的亚细胞定位试验circACLY主要存在于细胞质。此外,成功构建circACLY与ENTPD7的野生型/突变型双荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶报告基因系统检测证实gga-miR-6660-3p能够直接与cirACLY和ENTPD7的结合位点结合,并且circACLY能够吸附gga-miR-6660-3p提升ENTPD7的表达水平。（3）通过RT-PCR、CCK-8、EDU、Elisa和诱导分化试验等发现,gga-miR-6660-3p在静原鸡不同组织部位和不同发育阶段差异表达,并且gga-miR-6660-3p抑制imp从头合成途径促进成肌细胞的凋亡,抑制成肌细胞的增殖和分化。（4）通过RT-PCR、CCK-8、EDU和Elisa试验等发现,circACLY在静原鸡不同组织部位和不同发育阶段差异表达,circACLY促进成肌细胞的增殖、分化和imp从头合成途径,消除gga-miR-6660-3p对成肌细胞增殖、分化和imp从头合成途径的抑制作用。此外,circACLY抑制成肌细胞的凋亡,消除gga-miR-6660-3p对成肌细胞凋亡的促进作用。综上,本研究对静原鸡circACLY海绵吸附gga-miR-6660-3p调控imp从头合成途径影响成肌细胞的增殖、分化和凋亡进行了系统研究,丰富了 circRNA在地方鸡种中骨骼肌发育和imp合成的调控机制,为畜禽肉质遗传改良提供一定的理论基础。

关键词：静原鸡骨骼肌发育 circACLY gga-miR-6660-3p imp从头合成途径

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