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基于cAMP/PKA通路研究当归芍药散提取液对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤的保护作用

中国药理学通报 2019年第12期35卷 1765-1770页

作者：欧美凤刘浩坤杨沫王运来许钒安徽中医药大学药学院中药复方安徽省重点实验室

目的观察当归芍药散(Danggui-Shaoyao-San,DSS)提取液对阿霉素(adramycin,ADR)诱导损伤的内髓集合管(inner medullary collecting duct cell,imcd3)细胞Na^+,K^+-ATP酶、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)及水通道蛋白-2(aquaporin 2,AQP2)的影响,从水液平衡的角度探讨其相关的保护机制。方法以IMCD3细胞为研究对象,MTT法观察不同浓度ADR对IMCD3细胞增殖的影响;将细胞分为正常组、模型组、DSS提取液低、中、高剂量组(0.8、1.6、3.2 g·L^-1)、H-89抑制剂组;ELISA法检测细胞cAMP含量;试剂盒检测Na^+,K^+-ATP酶活性变化;Real-time PCR法检测PKA、CREB、水通道蛋白2(AQP2)mRNA表达;Western blot法检测Na^+,K^+-ATP酶、PKA、CREB、AQP2蛋白表达。结果ADR对IMCD3细胞的损伤最适浓度为1×10^-8 mol·L^-1;不同浓度的DSS提取液均可有效抑制ADR诱导IMCD3细胞损伤,提高Na^+,K^+-ATP酶活性及细胞上清cAMP含量(P3.2 g·L^-1)可上调PKA、CREB、AQP2 mRNA及蛋白表达(PIMCD3细胞损伤模型具有一定的保护作用,与提高Na+,K+-ATP酶活性、激活cAMP-PKA-CREB通路有关。

关键词：当归芍药散提取液 Na^+,K^+-ATP酶环磷酸腺苷蛋白激酶A 水通道蛋白2 IMCD3细胞

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当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤的作用及相关机制研究

当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤的作用及相关机制研究

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作者：刘浩坤安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的:本实验以集合管细胞(IMCD3细胞系)为研究对象,观察阿霉素诱导IMCD3细胞损伤后细胞凋亡、AQP2蛋白表达的变化;进一步探讨当归芍药散对阿霉素诱导imcd3损伤后cAMP、PKA、AQP2、Na-K-ATP酶蛋白表达的变化,初步探讨当归芍药散对阿霉素... 详细信息

目的:本实验以集合管细胞(IMCD3细胞系)为研究对象,观察阿霉素诱导IMCD3细胞损伤后细胞凋亡、AQP2蛋白表达的变化;进一步探讨当归芍药散对阿霉素诱导imcd3损伤后cAMP、PKA、AQP2、Na-K-ATP酶蛋白表达的变化,初步探讨当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤的作用机制研究。方法:第一部分不同浓度阿霉素对IMCD3细胞诱导损伤的研究1.MTT法检测不同浓度阿霉素对IMCD3细胞损伤的研究。观察不同浓度阿霉素作用下,IMCD3细胞生长状态的影响。2.倒置显微镜观察,随着阿霉素浓度变化,IMCD3细胞形态学的变化。3.Annexin V/PI染色法观察阿霉素的梯度变化,观察IMCD3细胞凋亡情况。4.Western blot法检测随着阿霉素浓度变化,IMCD3细胞AQP2蛋白表达的影响。MTT法及Annexin V/PI染色分为正常组、1×1077 mol/L组、1×1088 mol/L组、1×10mol/L组、1×10mol/L组、1×101111 mol/L组;Western blot法分为正常组、1×1088 mol/组、1×1099 mol/L组、1×10mol/L组、1×101111 mol/L组。第二部分不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞AQP2、Na-K-ATP酶蛋白表达的作用1.MTT法检测当归芍药散梯度对阿霉素损伤的IMCD3细胞的生长影响。2.Western blot法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导损伤的IMCD3细胞AQP2、Na-K-ATP酶蛋白表达。MTT法实验分为正常组、模型组、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL、12.8mg/mL;Western blot法实验分组正常组、模型组、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL.第三部分当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞损伤机制的研究1.ELISA法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞cAMP含量。2.Na-K-ATP酶测定盒检测当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞Na-K-ATP酶活性变化。3.Western blot法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞PKA、CREB、AQP2、Na-K-ATP蛋白表达的变化,探讨当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤机制的研究。实验分为正常组、模型组(阿霉素组)、当归芍药散低剂量组(0.2mg/mL)、当归芍药散中剂量组(1.6mg/mL)、当归芍药散高剂量组(3.2mg/mL)、H-89抑制剂组。结果:第一部分不同浓度阿霉素对IMCD3细胞AQP2蛋白表达的影响1.MTT法检测随着阿霉素梯度稀释后IMCD3细胞生长状态的影响。结果显示,较正常组比较,阿霉素浓度在1×1077 mol/L以上,OD值下降,形态学观察可见不同剂量的阿霉素对细胞呈现不同程度的抑制以及死亡,有显著性差异(P细胞凋亡率逐渐升高,差异具有显著性意义(P3.Western blot法检测结果显示,相比于正常组,阿霉素浓度为1×1088 mol/L,AQP2蛋白表达显著下调(P细胞凋亡率逐渐升高,差异具有显著性意义(Pimcd3的浓度作为最佳浓度以用于后续实验。第二部分不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞AQP2、Na-K-ATP酶蛋白表达的作用1.MTT法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞结果显示,较正常组比较,模型组IMCD3细胞生长增殖无明显影响(P>0.05);较模型组比较,0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml浓度下对IMCD3细胞生长增殖无明显影响(P>0.05),6.4mg/ml、12.8mg/ml对IMCD3细胞生长增殖具有不同程度

关键词：当归芍药散 IMCD3细胞 cAMP-PKA AQP2 Na+-K+-ATP酶

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