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第十二届全国免疫学学术大会

作者： li yanhong Di Zhang Lin Yikong Li Dajin Du Meirong Laboratory for Reproductive Immunology Hospital of Obstetrics and GynecologyFudan University Shanghai Medical College Department of Obstetrics Hospital of Obstetrics and GynecologyFudan University Shanghai Medical College

Mesenchymal stem cells(MSCs) are pluripotent cells with immunomodulatory properties and have been considered good candidates for the therapeutic treatment of several immune disorders including inflammatory bowel diseases(IBDs),Con A-induced liver injury and graft-vs.-host *** mouse model was induced by LPS which causes serious inflammatory responses and abundant infiltration of immune cells within ***,whether MSCs have the therapeutic effect in LPS-induced abortion mice is unclear and the mechanism remains ***,we demonstrate that *** of MSCs alleviated fetal loss in C57 BL/6 mice induced by *** MSCs promoted the decidual macrophage M2 switch via a direct interaction and also in an interleukin 1 receptor antagonist(illra)-dependent *** decidual macrophage educated by MSCs exhibited T-cell-suppressive activity,which inhibited the LPS induced pro-inflammatory responses in pregnant mouse *** of macrophages abrogated the MSCs-mediated attenuated inflammation in uterus and high ***,the results demonstrate the mechanism of MSCs reducing LPS-induced abortion by switching decidual macrophage towards M2 phenotype via the direct interaction and the secretion of il1 ra.

关键词： MSCs LPS abortion macrophage il1ra

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载il1ra的ALG-CHI微囊的制备及其对炎性肠病原位治疗的研究

载IL1Ra的ALG-CHI微囊的制备及其对炎性肠病原位治疗的研究

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作者：程锦江苏大学

学位级别：硕士

炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组反复发作的慢性胃肠道炎症性疾病,临床表现为腹痛、腹泻,甚至血便,由于其病程反复、迁延难愈,严重影响患者的生活质量。其病因和发病机制至今尚未明确,但已有研究显示与肠黏膜白细胞介... 详细信息

炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组反复发作的慢性胃肠道炎症性疾病,临床表现为腹痛、腹泻,甚至血便,由于其病程反复、迁延难愈,严重影响患者的生活质量。其病因和发病机制至今尚未明确,但已有研究显示与肠黏膜白细胞介素-1β(Interleukin-1β,il-1β)的数量增加密切相关。内生性白细胞介素1受体拮抗剂(Interleukin 1 receptor antagonist,il1ra)可抑制il-1β介导的信号通路,减轻或消除il-1β引起的生物效应,抑制相关次级炎症因子的产生,起到缓解或治疗炎性肠病的作用。il1ra作为蛋白质,直接口服给药易受到消化道极端pH值以及蛋白酶降解的影响从而丧失完整结构及生物活性,而注射给药存在半衰期短、注射部位过敏反应等问题。海藻酸-壳聚糖(Alginate-chitosan,ALG-CHI)微囊具有pH响应性,用于保护il1ra在消化道传递中的活性,并且可于结肠部位较高的pH环境下释放蛋白质药物,从而达到口服il1ra原位治疗IBD的目的,提高患者的用药依从性。本课题构建了可诱导表达il1ra的大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株,通过摸索诱导条件优化目的蛋白表达量,采用Ni柱亲和纯化得il1ra蛋白;使用静电喷雾法制备il1ra-ALG-CHI微囊,并对其pH响应性进行了体外实验验证,利用IBD小鼠模型对其体内治疗效果进行评价。本论文第二章将编码il1ra蛋白的基因序列插入pET30a表达载体,转化重组质粒pET30a-il1ra至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中并至固体LB培养基筛选培养。重组菌阳性克隆经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达形式,结果显示目的蛋白以可溶形式表达。通过Western Blot和Nano LCESI-MS/MS实验鉴定确认重组蛋白符合人源il1ra蛋白质的分子量及序列。本论文第三章通过测定BL21(DE3)工程菌的生长曲线确定进行IPTG诱导的时间,对工程菌的诱导条件进行摸索,以提高目的蛋白的表达量。得到的最优诱导工艺为:工程菌培养至第4个小时加入0.1 mmol/L的IPTG,在15°C条件下诱导培养14 h。Ni-IDA介质亲和层析纯化获得目的蛋白。本论文第四章采用静电喷雾法制备il1ra-ALG-CHI微囊,单因素和正交实验确定的最优制备工艺参数为:应用电压24 KV,注射液推进速度0.2 mL/h,针头距固化液液面高度11 cm,海藻酸钠粘度450 mPa·S。光学显微镜和扫描电子显微镜下的微囊呈现球形,粒径均一。分别测定微囊在模拟胃液、生理盐水、模拟肠液中的溶胀性及累计释放率,结果显示il1ra-ALG-CHI微囊具有pH响应性,有利于实现药物的结肠原位释药。本论文第五章通过葡聚糖硫酸钠诱导构建IBD小鼠模型,对正常组、模型组、il1ra-ALG-CHI微囊组、BSA-ALG-CHI微囊组和未包裹的il1ra组分别对应给药探究对IBD的缓解、治疗作用。结果显示,与其他治疗组相比,il1raALG-CHI微囊组小鼠DAI评分降低,结肠完整性较好、组织形态学良好、组织学损伤程度低,结肠组织MPO活性及炎症相关细胞因子(TNF-α、il-1β)浓度水平较低,il1ra蛋白可被微囊递送至结肠部位并释放,达到缓解及治疗IBD的效果。本课题通过构建可诱导表达il1ra的大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株,获得纯化后的目的蛋白,制备所得的具有pH响应性的il1ra-ALG-CHI微囊能够起到缓解、治疗IBD的效果,实现了口服il1ra蛋白用于IBD的结肠原位治疗,为开发蛋白质类药物治疗IBD提供新思路和新途径。

关键词： il1ra 海藻酸钠壳聚糖微囊炎性肠病

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一种同时连接il1ra和sTNFRI的纳米颗粒的构建及其在类风湿关节炎实验性治疗中的作用研究

一种同时连接IL1Ra和sTNFRI的纳米颗粒的构建及其在类风湿关节炎...

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作者：高秀苏州大学

学位级别：硕士

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种以关节病变为主的自身免疫性疾病,可导致软骨和骨骼损伤以及残疾。临床上主要采用药物治疗缓解患者病情,但长期使用这些药物也暴露出许多弊端,例如血液循环时间短、疗效较差以及毒副作用... 详细信息

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种以关节病变为主的自身免疫性疾病,可导致软骨和骨骼损伤以及残疾。临床上主要采用药物治疗缓解患者病情,但长期使用这些药物也暴露出许多弊端,例如血液循环时间短、疗效较差以及毒副作用严重等。这些局限推动了以纳米材料为基础的新型药物递送系统在ra治疗中的研究和应用。目的:制备装载小鼠或人的白细胞介素1受体拮抗剂(il1ra)和可溶性肿瘤坏死因子受体胞外端蛋白(此论文后续统一用sTNFRI表述)的纳米颗粒并对其性能进行测试。分别研究小鼠il1ra+sTNFRI纳米复合物和人il1ra+sTNFRI纳米复合物对胶原诱导的类风湿关节炎(collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA)的治疗作用,为临床治疗ra提供一种新的思路。实验内容:本论文分别表达并纯化出小鼠和人的il1ra、sTNFRI蛋白,利用NHS酯修饰将蛋白连接到纳米材料PLGA-PEG上,形成蛋白纳米复合物。实验内容主要包括纳米材料的表征、体外验证蛋白纳米复合物的生物学效应、体内验证蛋白纳米复合物的滞留时间以及在炎症部位的靶向性、对胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)小鼠的治疗效果的探索等。结果:1、分别纯化出小鼠和人的蛋白il1ra和sTNFRI。纳米颗粒(PLGA-PEG)的表征结果显示纳米颗粒形状相对规则,大小为60 nm左右,且具有良好的生物相容性和稳定性。2、成功将小鼠或人的il1ra和sTNFRI通过NHS修饰连接到纳米颗粒(PLGA-PEG)表面。且细胞实验表明NHS修饰没有影响il1ra和sTNFRI的生物学活性。3、活体成像实验结果进一步表明,小鼠il1ra+sTNFRI纳米复合物和人il1ra+sTNFRI纳米复合物都能够显著地延长蛋白il1ra和sTNFRI在小鼠关节处的滞留时间。通过活体成像技术分别检测了小鼠和人的蛋白纳米复合物在酵母聚糖诱导的关节炎(ZIA)小鼠模型中的存在时间,实验结果表明我们制备的蛋白纳米复合物具有被动靶向炎症部位的能力,能在炎症部位迅速富集且滞留更长时间。4、体内治疗实验结果表明,与其它组相比,装载小鼠或人的il1ra和sTNFRI的纳米颗粒能够中和体内过多的炎症因子il-1β和TNF-α。临床关节炎评分和组织切片也显示CIA小鼠的症状明显得到了缓解。最后,通过组织病理学分析表明我们制备的蛋白纳米复合物有着良好的生物安全性,有望实现临床上的转化。结论:本研究构建的装载小鼠或人的il1ra和sTNFRI的纳米颗粒不仅能够增加蛋白药物在关节腔内的滞留时间,又能在ZIA模型中迅速靶向炎症部位,并且在CIA小鼠体内也取得了较好的治疗效果,这为ra的治疗提供了潜在的新方法和策略。

关键词：类风湿性关节炎 il1ra sTNFRI 纳米颗粒 PLGA-PEG

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美国开始重组il1ra的临床试验

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生物技术通报 1991年第5期7卷 20-20页

作者：孙国凤

美国Synergen公司(科罗拉多州Boulder)公布8月向美国食品与药物管理局(FDA)申请在美国进行白细胞介素1受体拮抗蛋白(il1ra)的临床试验.il1ra是诱发炎症反应的淋巴因子il1的阻抑物质.仅在美国风湿性关节炎患者就有约200万人以上.此外,该... 详细信息

美国Synergen公司(科罗拉多州Boulder)公布8月向美国食品与药物管理局(FDA)申请在美国进行白细胞介素1受体拮抗蛋白(il1ra)的临床试验.il1ra是诱发炎症反应的淋巴因子il1的阻抑物质.仅在美国风湿性关节炎患者就有约200万人以上.此外,该公司为了将il1ra的适应范围扩大到革兰氏阴性细菌的感染性休克、炎症性大肠炎等,预定最近向食品与药物管理局申请临床试验.原来是与瑞士Roche公司开发il1ra.但是1990年废除了合同,现在由Synergen公司单独开发.

关键词：临床试验 il1ra 感染性休克风湿性关节炎炎症反应淋巴因子科罗拉多州革兰氏阴性细菌白细胞介素 Roche

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人白介素-1受体拮抗剂融合蛋白的构建、表达及生物学活性鉴定

人白介素-1受体拮抗剂融合蛋白的构建、表达及生物学活性鉴定

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作者：戴寿沣浙江大学

学位级别：硕士

il1ra是生物体内的一种天然的蛋白质分子,与il-1α、il-1β同为il-1家族的成员,其本身无任何激动剂的作用,但能特异性地与il-1受体结合,从而拮抗il-1的各种生物学效应。一系列的证据证明il-1在ra发病的慢性炎症过程中具有重要的作用,il... 详细信息

il1ra是生物体内的一种天然的蛋白质分子,与il-1α、il-1β同为il-1家族的成员,其本身无任何激动剂的作用,但能特异性地与il-1受体结合,从而拮抗il-1的各种生物学效应。一系列的证据证明il-1在ra发病的慢性炎症过程中具有重要的作用,il1ra由于可以特异性地抑制il-1的生物学功能,因此在ra的治疗中备受重视。2001年,由Amgen公司生产的重组人白细胞介素1受体拮抗剂（rhlL1ra,药品名称Kineret）被美国食品与药品管理局（FDA）和欧洲EMEA批准上市,用于治疗类风湿关节炎（ra）。但是,由于illra相对分子质量较小,半衰期短,使用过程中患者皮下注射rhlL1ra时,要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药,一般每天注射一次,一个疗程为半年,频繁用药加重了患者的身体、心理和经济负担,因此临床上急需研发长效的重组rhil1rao本研究旨在采用蛋白融合技术延长il1ra在体内作用的半衰期,设计了以人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）为载体蛋白融合il1ra的融合蛋白。作为血浆的重要成分之一,HSA是许多内源因子和外源药物的载体,正常情况下不易透过肾小球。在血浆中的半衰期长达2周,体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性,因而是一种理想的生物活性蛋白载体。通过基因工程技术将HSA基因与il1ra基因融合,以期获得既不丧失il1ra生物活性,且能显著地延长其在血浆中半衰期的融合蛋白。这样的融合蛋白能够降低给药频率,发挥与il1ra相似或更好的治疗作用。 1.融合基因的构建及鉴定用PCR法从人胎肝cDNA文库获得成熟态血清白蛋白基因,长度大约为1.8kb,再将PCR产物克隆入pGEM-T载体中。再经PCR获得不同修饰的HSA、il1ra基因,构建HSA与il1ra的融合基因,并克隆至pPIC9载体中。用PstI、XhoI、EcoRI酶切鉴定重组质粒,再经测序证明已成功构建。 2.毕赤酵母转化及PCR法鉴定制作毕赤酵母GS115（SMD1168）感受态细胞,将用SalI线性化的重组表达载体转化至毕赤酵母GS115（SMD1168）中。转化后铺于不含组氨酸的RDB平板,30℃培养3天后长出一批毕赤酵母转化子。以重组酵母的基因组为模板,用5’-AOX1和3’-AOX1为引物进行PCR检测,电泳在2.2kb处有一明显条带。结果显示HSA/il1ra融合基因表达盒已经成功的整合至酵母基因组中。 3.毕赤酵母转化子摇瓶诱导表达及鉴定随机挑选的多个毕赤酵母转化子,经摇瓶培养,诱导表达72h,电泳鉴定在84kD处出现目标条带的转化子并保存。选取表达量最高的转化子进行发酵培养,取诱导表达12h、24h、48h、72h的发酵液,离心取上清进行SDS-PAGE分析。电泳鉴定发现随着诱导时间的延长,培养基中的分泌蛋白的量增多,在诱导72h时表达量最高,发酵液中HSA-G-il1ra融合蛋白的浓度约为200mg/L。 4.融合蛋白的纯化离心收集发酵诱导表达72h的发酵液上清,硫酸铵沉淀,重溶脱盐处理后,经亲和柱、离子交换柱、凝胶柱纯化后得到较纯的融合蛋白。经反相HPLC检测其纯度大于90%。 5. Western Blotting免疫印迹分析免疫印迹结果分析显示凝胶电泳中的84kD条带既能与兔抗HSA抗血清发生特异性结合,也能与鼠抗人il1ra单克隆抗体之间发生特异性结合。说明融合蛋白同时具有HSA和il1ra抗原性。免疫印迹的结果验证了融合蛋白中存在HSA和il1ra两个结构域。 6.融合蛋白的生物学活性测定按中国药检所推荐方法用细胞株A375.S2来测定rhil1ra的生物效价。生物学活性测定结果表明本研究构建表达的HSA/il1ra融合蛋白具有与illra相似的活性,能拮抗il-1对A375.S2细胞的杀伤作用,并且保护作用呈剂量依赖性。 7.融合蛋白的药代动力学对小鼠进行皮下注射HSA-G-il1ra融合蛋白,在不同时间点取血,用ELISA方法对血样进行检测,通过统计学方法得到融合蛋白的药代动力学参数：半衰期为8.125h、是rhil1ra的17.6倍。清除率为0.182 L/h/kg,是rhil1ra的0.18倍。证实HSA-G-il1ra融合蛋白具有长效性。 8.融合蛋白的结构鉴定通过Western Blotting、N-端氨基酸测序及圆二色谱分析,证实HSA-G-il1ra融合蛋白具有正确的HSA和illra氨基酸序列及结构特征。综上所述：本研究成功构建了HSA与illra的融合基因,并在毕赤酵母表达体系中获得成功表达;经SDS-PAGE、Western Blot

关键词： il1ra HSA 融合蛋白分泌表达毕赤酵母长效

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