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莱茵衣藻ift20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定

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食品与生物技术学报 2023年第11期42卷 106-112页

作者：贾瑞勤贾航郑学超薛斌樊振川天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学大健康生物技术国家国际科技合作基地天津300457

莱茵衣藻鞭毛内运输(intraflagellar transport,ift)蛋白ift20是ift蛋白复合物B(ift-B)的组分之一。虽然ift20参与调控细胞内大分子的胞内运输过程,但其作为一个鞭毛蛋白在鞭毛内的详细功能仍有待研究。为了开发高特异性的莱茵衣藻ift2... 详细信息

莱茵衣藻鞭毛内运输(intraflagellar transport,ift)蛋白ift20是ift蛋白复合物B(ift-B)的组分之一。虽然ift20参与调控细胞内大分子的胞内运输过程,但其作为一个鞭毛蛋白在鞭毛内的详细功能仍有待研究。为了开发高特异性的莱茵衣藻ift20兔源多克隆抗体,作者首先在大肠杆菌中表达了N端6×His标签标记的ift20融合蛋白(6×His::ift20),并对其进行镍柱纯化,将纯化所得6×His::ift20蛋白免疫新西兰大白兔。采集3次免疫后的抗血清,利用间接ELISA法测定其效价为1∶102400。利用protein A纯化珠对所得抗血清进行了IgG亚型抗体富集,接着用大肠杆菌表达纯化所得N端MBP标签标记的ift20(MBP::ift20),并对IgG抗血清进行抗原抗体亲和纯化。经对CC-125藻种全细胞蛋白质提取物进行免疫印迹法鉴定,所得ift20多克隆抗体特异性较高,适合用于后续莱茵衣藻ift20鞭毛内运输功能的研究。

关键词：莱茵衣藻鞭毛内运输 ift20 多克隆抗体

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ift20表达在肝星状细胞活化及肝纤维化发展中的作用机制研究

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IFT20表达在肝星状细胞活化及肝纤维化发展中的作用机制研究

作者：周明慧华中科技大学

学位级别：硕士

研究背景与目的肝纤维化的发生、发展十分复杂,是多种慢性肝损伤共有的病理改变,也是是绝大多数肝病发展到肝硬化的必经阶段。中国的慢性肝损伤患者人数众多,如不及时干预,可进展成为失代偿期肝硬化,其终末期并发症可严重影响患者的生... 详细信息

研究背景与目的肝纤维化的发生、发展十分复杂,是多种慢性肝损伤共有的病理改变,也是是绝大多数肝病发展到肝硬化的必经阶段。中国的慢性肝损伤患者人数众多,如不及时干预,可进展成为失代偿期肝硬化,其终末期并发症可严重影响患者的生命安全。而肝纤维化发生发展的中心环节是肝星状细胞（HSC）的活化。纤毛存在于真核细胞表面。最近有研究提出纤毛的缺失与肝纤维化相关,而纤毛内转运（ift）是纤毛生成及维持正常功能的关键,可运输多种蛋白质及传递相关信号分子,从而维持细胞内外环境的稳定。纤毛内转运的正常运转又依赖于多种纤毛内转运蛋白的协作。ift20属于ift-B复合体,在肝脏大量表达。目前并无相关ift20在肝纤维化发生发展中的作用机制研究。因此,本研究旨在探讨ift20是否参与肝星状细胞的活化以及肝纤维化的发生发展。方法利用四氯化碳（CCL4）法构建小鼠肝纤维化模型,通过HE染色、Masson染色以及Sirius Red染色法检测造模效果;通过real-time PCR、Western blot、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）检测ift20在正常及肝纤维化小鼠模型肝组织中的表达及分布,免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）检测ift20在正常及肝纤维化患者肝组织中的表达及分布。利用转化生长因子TGF-β1刺激人肝星状细胞LX-2和小鼠肝星状细胞HSC-T6,通过real-time PCR、Western blot检测肝纤维化相关指标α-SMA及ift20的表达变化。通过si RNA及ift20过表达质粒转染LX-2构建ift20低表达和过表达细胞株,通过real-time PCR、Western blot检测ift20的表达变化对HSCs活化影响;通过CCK-8细胞增殖实验检测ift20的表达水平变化是否影响LX-2细胞增殖能力,通过细胞划痕实验与Transwell小室实验检测ift20的表达水平变化是否影响LX-2的迁移能力。通过real-time PCR、Western blot检测当LX-2进一步活化后ift20的表达变化是否与hedgehog信号通路相关,利用hedgehog通路抑制剂（cyclopamine）处理LX-2,通过real-time PCR、Western blot检测ift20的表达变化。结果ift20表达于肝星状细胞中,并主要存在于肝细胞中。相较于正常肝组织,肝纤维化患者及四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型中的ift20表达升高,且在肝纤维化小鼠模型中,ift20的表达在一定程度上与肝纤维化呈正比（p＜0.05）。LX-2和HSC-T6经TGF-β1刺激后,TGF-β1在显著诱导肝纤维化相关指标表达增高的同时,ift20的表达也显著增高（p＜0.05）。通过si RNA抑制LX-2中ift20表达后,肝纤维化相关指标表达随之下调,hedgehog信号通路下游分子表达下调,并且LX-2细胞系的增殖及迁移能力也相应减弱。相反,过表达ift20则发挥与上述相反的作用。通过hedgehog信号通路抑制剂处理LX-2后,肝纤维化相关指标及ift20表达下调（P＜0.05）。结论ift20通过hedgehog通路促进HSCs活化及肝纤维化的发生、发展,为逆转肝纤维化的发生发展提供了新思路。

关键词： ift20 hedgehog信号通路肝星状细胞肝纤维化纤毛内转运

ift20相关蛋白与肺腺癌患者预后的关联性研究

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IFT20相关蛋白与肺腺癌患者预后的关联性研究

作者：李连凤武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:分析ift20相关蛋白(intraflagellar transport 20,ift20、cis-golgi protein GM130、Sonic Hedgehog,SHh和receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2,ROR2蛋白)在肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况及其与患者临床病理特征及预后情况的关系,为早期诊断肺腺癌及评估其预后情况提供新的可能靶点。材料与方法:本研究随机选取了华中科技大学同济医学院附属同济医院2010年3月至2015年9月入院后行肺癌切除术的235例肺腺癌患者并随访至2018年6月。收集患者的基本信息、临床病理特征资料及术中切除的肺癌组织和癌旁组织。采用组织芯片和免疫组化技术检测分析ift20相关蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达情况,采用Image J软件对组织芯片进行IOD/Area和阳性细胞率评分,五名经专业培训的人员在不知患者临床资料的情况下根据染色的深浅对蛋白进行染色强度评分,其中未着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。符合正态分布的连续性变量采用独立样本的t检验或方差分析,不符合正态分布的连续性变量采用独立样本的Wilcoxon或Kruskal-Wallis秩和检验,分类变量采用卡方检验或Fisher确切概率法。Pearson相关或Spearman秩和相关分析ift20相关蛋白之间的关系;多元Logistics回归分析ift20相关蛋白的表达与肺腺癌临床病理特征之间的关系;多元Cox比例风险回归模型分析ift20相关蛋白的表达与肺腺癌患者预后情况之间的关系。采用SPSS 26.0软件进行统计学分析,P3cm、肿瘤发生淋巴结或远处转移,以及肿瘤发展为II～Ⅳ期是影响肺腺癌患者预后的危险因素,其HR及95%CI分别为2.22(1.31,3.76),1.75(1.24,2.45),2.37(1.41,3.98),1.47(1.04,2.08),2.18(1.51,3.16)和2.23(1.45,3.42),而接受化疗/放疗是肺腺癌患者预后的保护因素,其HR及95%CI为0.58(0.43,0.80)。(2)肺腺癌患者癌组织中ift20和SHh蛋白的表达明显高于癌旁组织;GM130和ROR2蛋白的染色强度评分显著高于癌旁组织(Pift20、GM130、SHh和ROR2蛋白之间的关系在癌组织和癌旁组织中均呈显著正相关(Pift20、GM130和SHh蛋白的表达分别与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤细胞低分化类型和肿瘤大小等临床病理特征之间呈显著负相关,蛋白表达每增加一个单位,会降低肿瘤发展为III～Ⅳ期、发生淋巴结转移、肿瘤细胞转化为低分化类型和肿瘤发展为较大体积(>7cm)的风险,其OR及95%CI分别为0.65(0.44,0.96),0.63(0.40,0.99),0.71(0.53,0.94),0.97(0.94,0.99),0.64(0.41,0.98),0.97(0.95,0.99)和0.58(0.36,0.94)。而ROR2蛋白的表达与肿瘤大小呈显著正相关,阳性细胞率每增加一个百分点,肿瘤发展为较大体积(>7cm)的风险增加8%,其OR及95%CI为1.08(1.01,1.16)。(4)SHh蛋白的表达对肺腺癌患者的预后具有保护作用,其HR及95%CI为0.60(0.46,0.80)。在肿瘤细胞为中高分化类型、肿瘤>7cm和发生远处转移的人群中,GM130和SHh蛋白的表达对于肺腺癌患者的预后具有保护作用(Pift20蛋白的表达会增加肿瘤发生远处转移患者死亡的风险(P3cm、肿瘤发生淋巴结转移或远处转移、肿瘤发展为II～Ⅳ期是影响肺腺癌患者预后的危险因素,而接受化疗/放疗是肺腺癌患者预后的保护因素。(2)ift20、GM130和SHh蛋白的表达与肺腺癌临床病理特征之间呈显著负相关,蛋白表达水平越高,会降低肿瘤细胞向低分化类型转化和向癌症晚期发展的风险,有利于肺腺癌患者的预后。而ROR2蛋白的表达与肿瘤大小呈显著正相关,蛋白表达越高,肿瘤向较大体积发展的风险越高。

关键词：肺腺癌 ift20 GM130 SHh ROR2 临床病理特征生存情况

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157例卵巢肿瘤中ift20的表达及意义

临床与实验病理学杂志 2014年第7期30卷 736-740页

作者：牛娜刘乾程丽哈尔滨医科大学附属肿瘤医院妇科哈尔滨150040

目的观察纤毛内转运蛋白20(intraflagellar transport 20,ift20)在卵巢良、恶性肿瘤中的表达,探讨其与卵巢癌发生、发展及预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测ift20在157例卵巢肿瘤组织中的表达,其中浆液性囊腺癌52例、黏液性囊腺癌2... 详细信息

目的观察纤毛内转运蛋白20(intraflagellar transport 20,ift20)在卵巢良、恶性肿瘤中的表达,探讨其与卵巢癌发生、发展及预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测ift20在157例卵巢肿瘤组织中的表达,其中浆液性囊腺癌52例、黏液性囊腺癌22例、子宫内膜样腺癌14例、透明细胞腺癌10例、交界性卵巢肿瘤25例、良性肿瘤18例及正常卵巢组织16例。结果(1)ift20在卵巢癌组织(76.5%,75/98)和交界性肿瘤组织(32%,8/25)中的阳性率明显高于卵巢良性肿瘤(16.6%,3/18)和正常卵巢组织(12.5%,2/16),组间差异有统计学意义(Pift20蛋白在不同FIGO分期和组织学分级的卵巢癌组织中的表达差异有显著性(Pift20蛋白的表达显著升高;(3)ift20蛋白表达强弱与患者生存时间呈负相关(Pift20蛋白表达与卵巢癌患者年龄无关。结论 ift20蛋白与卵巢癌的发生、浸润和转移相关,在一定程度上可判断卵巢癌恶性程度和评估临床预后,同时为卵巢癌的靶向治疗提供新靶点。

关键词：卵巢肿瘤 ift20 预后免疫组织化学

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SPATA1与纤毛内转运蛋白ift20的相互作用及其在精子发生中的表达和定位

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SPATA1与纤毛内转运蛋白IFT20的相互作用及其在精子发生中的表达...

作者：申鑫武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:进一步验证精子发生相关蛋白SPATA1与鞭毛内转运蛋白ift20之间的相互作用,探索SPATA1在精子发生中的表达、定位及作用。方法:ift20和SPATA1蛋白表达质粒转染CHO细胞,免疫荧光检测其共定位;同时,ift20/Flag和SPATA1/GFP共转染COS-1... 详细信息

目的:进一步验证精子发生相关蛋白SPATA1与鞭毛内转运蛋白ift20之间的相互作用,探索SPATA1在精子发生中的表达、定位及作用。方法:ift20和SPATA1蛋白表达质粒转染CHO细胞,免疫荧光检测其共定位;同时,ift20/Flag和SPATA1/GFP共转染COS-1细胞,细胞裂解物进行免疫共沉淀,进一步验证两者之间的相互作用。构建SPATA1/pEGFP-N2质粒,将其和对照质粒pEGFP-N2转染到COS-1细胞中,细胞裂解物进行Western blotting,检测SPATA1多克隆抗体的特异性。以SPATA1和ift20为一抗,免疫荧光染色观察两者在睾丸生精细胞的表达与定位。收集野生型小鼠附睾精子,Western blotting和免疫荧光检测SPATA1在成熟精子中的表达。提取ift20基因敲除小鼠和对照小鼠睾丸的总蛋白以及制备睾丸组织切片,Western blotting和免疫荧光检测ift20缺失对SPATA1在睾丸组织中的表达与定位的影响。结果:细胞内蛋白定位实验结果显示ift20和SPATA1在CHO细胞中部分共定位,形成簇团;COS-1细胞共转染ift20/Flag和SPATA1/GPF表达质粒时,Flag抗体将ift20和SPATA1同时沉淀下来。Western blotting实验显示制备的SPATA1抗体能有效识别该蛋白。小鼠睾丸组织和附睾成熟精子的免疫荧光染色显示,在圆形精子细胞的顶体检测到SPATA1蛋白信号,但在成熟精子未发现该蛋白的表达。ift20也定位于圆形精子细胞的顶体。与对照组小鼠(ift20;Stra8-Cre)相比,ift20缺失对睾丸组织中SPATA1蛋白表达水平没有显著影响。免疫荧光结果显示,精子发生的IV-XII期间,ift20基因敲除小鼠和对照小鼠中SPATA1表达与定位相似;在精子发生第12阶段(step12),ift20基因敲除小鼠的精子细胞核未正常伸长,SPATA1未沿着顶体分布。结论:SPATA1与ift20形成蛋白复合体,并可能通过调控ift20介导的蛋白运输参与精子顶体形成。

关键词： SPATA1 ift20 精子发生顶体男性生殖

下调ift20表达对人肝星状细胞自噬及凋亡的机制研究

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下调IFT20表达对人肝星状细胞自噬及凋亡的机制研究

作者：金富昌华中科技大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨能否通过下调纤毛内转运蛋白20(Intraflagellar transport20,ift20)的表达来抑制肝星状细胞活化、自噬并诱导其凋亡,以期为肝纤维的防治提供一个新靶点。方法:利用ift20-RNAi干扰慢病毒转染人肝星状细胞系LX-2,使用G... 详细信息

目的:本研究旨在探讨能否通过下调纤毛内转运蛋白20(Intraflagellar transport20,ift20)的表达来抑制肝星状细胞活化、自噬并诱导其凋亡,以期为肝纤维的防治提供一个新靶点。方法:利用ift20-RNAi干扰慢病毒转染人肝星状细胞系LX-2,使用G418筛选出ift20低表达细胞株,在此基础上使用TGF-β1刺激LX-2细胞活化,通过RT-PCR检测其活化标志蛋白α-SMA、Collagen I、CollagenⅢ、PDGFR及MMP-1的表达水平,Western Blot验证α-SMA及Collagen I的表达水平;通过细胞免疫荧光、透射电镜观察自噬小体,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、AGT5、Beclin1的表达水平;使用氯喹(Chloroquine,CQ)抑制自噬,通过Western Blot、细胞免疫荧光检测自噬流;转染GFP-RFP-LC3双标慢病毒,在荧光显微镜下观察自噬小体及自噬溶酶体的数量;用ift20-si RNA瞬时转染LX-2细胞48小时,通过TUNEL染色及流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、BCL-2、Caspase3及Cleaved-caspase3的表达水平;筛选Purmorphamine作用LX-2细胞的有效浓度,在下调ift20表达基础上使用Purmorphamine作用LX-2细胞,通过RT-PCR检测Hedgehog通路效应因子SMO、Gli1及Gli2表达水平,Western Blot及细胞免疫荧光检测Gli1的表达及定位;Transwell检测细胞迁移能力,CCK8检测增殖。结果:下调ift20表达可抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化,并降低自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平,对AGT5、Beclin1及P62表达无明显影响;透射电镜及细胞免疫荧光显示下调ift20表达导致自噬小体数量减少;使用溶酶体抑制剂CQ抑制自噬,显示下调ift20表达可抑制自噬流;GFP-RFP-LC3双标慢病毒转染后显示下调ift20表达后自噬小体及自噬溶酶体数量均减少;转染si RNA抑制LX-2细胞ift20的表达可诱导其凋亡;下调LX-2细胞中ift20表达可抑制Hedgehog通路且Hedgehog通路激活具有ift20依赖性;下调ift20表达抑制LX-2细胞活化、自噬并诱导其凋亡与Hedgehog通路失活有关。结论:下调ift20表达可通过抑制Hedgehog信号通路来抑制人肝星状细胞活化、自噬并诱导其凋亡。

关键词：肝纤维化肝星状细胞 ift20 Hedgehog信号通路

鞭毛内转运蛋白ift20、ift52及ift88与畸形精子症、弱精子症之间的相关性研究

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鞭毛内转运蛋白IFT20、IFT52及IFT88与畸形精子症、弱精子症之间...

作者：钟亚楠扬州大学

学位级别：硕士

目的:据统计,我国不孕不育人口已超过4000万,约占育龄人口比例的12.5%,但其治愈率却不到30%。在不孕不育的育龄夫妇中,由男方因素引起的不育占50%。男性不育是一种具有高度异质性表型的多因素复杂疾病,其中,遗传因素占了至少15%,包括染... 详细信息

目的:据统计,我国不孕不育人口已超过4000万,约占育龄人口比例的12.5%,但其治愈率却不到30%。在不孕不育的育龄夫妇中,由男方因素引起的不育占50%。男性不育是一种具有高度异质性表型的多因素复杂疾病,其中,遗传因素占了至少15%,包括染色体和单基因改变,畸形精子症和弱精子症是其常见的临床表现。临床上诊断男性不育症的首选方法是精液分析,但传统的精液分析不能明确不育症的发病病因,因此需要对临床男性不育症的病因诊断进行进一步的探索。在小鼠中的研究已经表明,鞭毛内转运(intraflagellar transport,ift)对小鼠的精子发生和雄性生育是至关重要的,一些ift分子的缺失可导致精子结构与功能的异常,进而引起雄鼠不育。在人类中也报道了 ift139、ift140与ift144突变可以引起男性不育,然而更多的ift分子在人类生殖中的确切作用尚不明确。本研究中,我们首先分析了ift20、ift52、ift88在小鼠中的表达模式,以验证其在小鼠精子发生和雄性生育中的作用。然后分析了 ift20、ift52、ift88在人睾丸及精子中的表达,观察其在人体中是否具有类似的表达模式,并探索ift20、ift52、ift88与畸形精子症和弱精子症患者之间的相关性,以期为临床男性不育症寻找潜在的病因诊断标志物,并为不育症的诊治提供新的思路。方法:在小鼠中,通过RT-PCR分析ift20、ift52、ift88 mRNA在成年小鼠多组织以及不同发育阶段小鼠睾丸组织中的表达;通过Western Blot分析ift20、ift52、ift88蛋白在成年小鼠多组织以及不同周龄小鼠睾丸组织中的表达;通过免疫荧光分析ift20、ift52、ift88在成年小鼠睾丸组织细胞以及成熟精子中的定位。在人体中,通过Western Blot分析ift20、ift52、ift88蛋白在正常成人睾丸组织和正常成人精子中的表达,通过免疫荧光分析ift20、ift52、ift88在正常成人精子中的定位;通过Western Blot分析了 ift20、ift52、ift88蛋白在畸形精子症、弱精子症不育患者精子中的相对含量;应用统计学方法分析了 ift20、ift52、ift88在畸形精子症不育患者精子与正常成人精子、弱精子症不育患者精子与正常成人精子之间的表达有无差异性。结果:1.在小鼠中,ift20 mRNA在成年小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、附睾和睾丸组织中均有表达,ift20蛋白主要表达于附睾及睾丸组织,在肝、脾、肺、肾、脑和胃表达微弱,ift20 mRNA和ift20蛋白均从出生后第7d的小鼠睾丸组织中就已开始表达,并持续到成年,而且表达量维持在较高水平;免疫荧光显示ift20定位于小鼠生精小管精母细胞往后的各级生精细胞胞质中,并且在第Ⅱ期-第Ⅲ期及第Ⅴ期-第Ⅺ期呈现较高的表达水平,在第Ⅰ期、第Ⅳ期和第Ⅻ期表达稍弱,其在小鼠成熟精子中定位于精子核后环及精子尾部全长。在人体中,ift20在正常成人睾丸组织及精子、畸形精子症不育患者精子、弱精子症不育患者精子中均有表达,ift20定位于正常成人精子的核后环及尾部全长。ift20在62例正常成人精子中的相对含量为1.09±0.62,在48例畸形精子症不育患者精子中的相对含量为1.52±1.73,其在畸形精子症不育患者精子中相对含量与正常成人精子相比,p值为0.115,因p值>0.05,所以ift20在畸形精子症不育患者精子中的相对含量与在正常成人精子中的相对含量无显著性差异。ift20在32例弱精子症不育患者精子中的相对含量为1.23±0.83,经统计学分析发现,其在弱精子症不育患者精子中相对含量与正常成人精子相比,p值为0.502,因p值>0.05,所以ift20在弱精子症不育患者精子中的相对含量与在正常成人精子中的相对含量也无显著性差异。2.在小鼠中,ift52 mRNA主要表达于肝、肺、脑和附睾组织中,在心、脾、肾和睾丸组织中弱表达,ift52蛋白主要表达于睾丸组织中,在肝、脾、肺、肾、脑、胃、附睾弱表达,ift52 mRNA和ift52蛋白均从出生后第7d的小鼠睾丸组织中就已开始表达,并持续到成年,而且表达量维持在较高水平;免疫荧光显示ift52在小鼠生精小管和睾丸间质中均有表达,在生精小管中,它表达于精原细胞、初级精母细胞往后的各级生精细胞胞质,也表达于支持细胞胞质,其在第Ⅰ期-第Ⅻ期信号均很强,ift52定位在小鼠精子头部核后环及精子尾部全长。在人体中,ift52在正常成人睾丸组织及精子、畸形精子症不育患者精子、弱精子症不育患者精子中均有表达,并且ift52定位于正常成人精子的核后环及尾部全长。ift52在62例正常成人精子中的相对含量为0.99±0.43,在48例畸形精子症不育患者精子中的相对含量

关键词： ift20 ift52 ift88 畸形精子症弱精子症相关性分析

莱茵衣藻ift20的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

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莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

作者：贾瑞勤天津科技大学

学位级别：硕士

莱茵衣藻是一种单细胞藻类生物,具有繁殖快,培养方式简单,纤毛和细胞体容易分离等特点,是研究纤毛组装和纤毛病的理想模式生物。纤毛组装和维持所需要的前体蛋白是依赖一种称为纤毛内运输机制ift(intraflagellar transport,ift)的方式... 详细信息

莱茵衣藻是一种单细胞藻类生物,具有繁殖快,培养方式简单,纤毛和细胞体容易分离等特点,是研究纤毛组装和纤毛病的理想模式生物。纤毛组装和维持所需要的前体蛋白是依赖一种称为纤毛内运输机制ift(intraflagellar transport,ift)的方式输入和输出纤毛。纤毛作为特异化的细胞天线,在细胞内信号传导中发挥重要的作用。许多信号分子,如G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道和其它类型的信号蛋白,均定位于纤毛,这些是纤毛作为信号天线的分子基础。因此,纤毛组装缺陷或者功能缺失将导致信号蛋白定位异常,最终导致一系列先天性疾病,如BardetBiedl综合症(BBS),Joubert综合症和Meckel综合症等,这些与纤毛相关的疾病统称为纤毛病,其临床症状包括肥胖症、糖尿病、多指症、智力迟缓等。ift主要是由ift复合物和马达蛋白组成。ift复合物是由ift-A和ift-B两个亚蛋白复合物组成,其中ift-B可进一步分为ift-B1和ift-B2两个蛋白复合物。ift是一种双向运输系统,其中ift-B和马达蛋白Kinesin-II调控纤毛蛋白从基部到顶部的正向运输,而ift-A和马达蛋白dynein调控纤毛蛋白从纤毛顶部到基部的反向运输。ift20是ift-B2蛋白复合物亚基,但是其作为一个纤毛蛋白在纤毛内的详细功能仍待研究。因此,本研究旨在开发一种高特异性的莱茵衣藻ift20多克隆抗体,为后续其在纤毛内功能研究奠定基础。为此,首先在大肠杆菌中表达N-端6×His标签标记的ift20融合蛋白(6×His::ift20)并对此蛋白进行镍柱亲和纯化,然后将纯化所得6×His::ift20蛋白作为抗原对新西兰大白兔进行免疫。收集3次免疫抗血清,利用间接ELISA法测定抗血清效价为1:102400。尔后利用protein A纯化珠对所得抗血清进行了Ig G亚型抗体富集,接着利用大肠杆菌表达纯化所得N-端MBP标签标记的ift20(MBP::ift20)对Ig G抗血清进行抗原抗体亲和纯化。最后,利用纯化所得的ift20抗体对CC-125藻种全细胞蛋白提取物进行蛋白免疫印迹鉴定,可知纯化所得ift20多克隆抗体特异性较高,适用于后续莱茵衣藻ift20纤毛内功能研究。

关键词：莱茵衣藻纤毛内运输 ift20 多克隆抗体

非小细胞肺癌中ift20、MMP-2和MMP-9表达关系的研究

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中华临床医师杂志（电子版） 2015年第10期9卷 187-189页

作者：牛灵董雅璐新疆自治区人民医院呼吸科乌鲁木齐830000 兰州军区乌鲁木齐总医院肿瘤内科 830000

目的检测非小细胞肺癌患者术后组织中细胞纤毛转运蛋白20(ift20)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,研究三者在肿瘤中表达的差异。方法选取确诊的87例非小细胞肺癌术后组织作为观察组,选取60例正常支气管黏膜... 详细信息

目的检测非小细胞肺癌患者术后组织中细胞纤毛转运蛋白20(ift20)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,研究三者在肿瘤中表达的差异。方法选取确诊的87例非小细胞肺癌术后组织作为观察组,选取60例正常支气管黏膜组织作为对照组,应用免疫组化SP法检测两组中ift20、MMP-2和MMP-9的表达特点。结果两组中ift20、MMP-2和MMP-9表达的阳性率差别均有统计学意义。观察组中ift20、MMP-2和MMP-9的表达与肿瘤的最大径、是否伴有坏死、淋巴结转移均具有相关性。线性相关分析显示ift20和MMP-2、ift20和MMP-9的表达均具有正相关性。结论非小细胞肺癌术后组织ift20、MMP-2和MMP-9高表达可以促进肿瘤的发生和进展,ift20在发挥作用过程中可能对MMP-2和MMP-9的表达有重要调节作用。

关键词：癌,非小细胞肺基质金属蛋白酶类免疫组织化学 ift20

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