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坦布苏病毒sfRNA的功能鉴定及结合宿主蛋白的筛选

坦布苏病毒sfRNA的功能鉴定及结合宿主蛋白的筛选

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作者：安达山东农业大学

学位级别：硕士

坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)是一种RNA病毒,其具有不分节段的单股正链基因组结构,主要引起产蛋鸭产蛋下降及雏鸭瘫痪。自2010年坦布苏病毒病首先在我国东南地区爆发以来,以其宿主广泛、传播迅速等特点迅速蔓延到我国养鸭主产区,严... 详细信息

坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)是一种RNA病毒,其具有不分节段的单股正链基因组结构,主要引起产蛋鸭产蛋下降及雏鸭瘫痪。自2010年坦布苏病毒病首先在我国东南地区爆发以来,以其宿主广泛、传播迅速等特点迅速蔓延到我国养鸭主产区,严重危害了我国水禽业的健康发展。TMUV在内的黄病毒属成员能够产生一种截短的3’非翻译区(Untranslated region,3’UTR)的RNA形式,被称为黄病毒亚基因组RNA(subgenomic flavivirus RNA,sfRNA)。sfRNA的产生是由于XRN1核酸外切酶对黄病毒基因组RNA的降解作用受到了3’UTR自身保守的茎环结构的阻挡作用。作为近年来新发现的黄病毒重要毒力因子之一,sfRNA在促进病毒复制、拮抗天然免疫等方面发挥重要功能。本研究以TMUV为对象,首先确定TMUV-sfRNA抑制ifn-β及干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,iSGs)的生成,其次sfRNA过表达状态下显著促进TMUV基因组的复制;随后利用RNA pulldown联合质谱分析技术对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblasts,DEF)中与TMUV-sfRNA特异性结合的宿主蛋白进行筛选,以期进一步阐明TMUV致病机制。本研究主要包括以下几方面内容:***-sfRNA TaqMan探针检测方法的建立根据TMUV-sfRNA基因序列设计引物和特异性探针,扩增长度为171 bp。将该片段克隆到p MD18-T中倍比稀释作为标准品,优化试验条件并绘制标准曲线。线性关系回归方程为y=-2.592x+33.918,相关系数R=0.9969。经验证,该检测方法敏感性良好,最小检出模板浓度为10 copies/μL;特异性良好。以上结果表明,本研究所建立的Taq Man探针检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,可应用于TMUV-sfRNA拷贝值的测定。***-sfRNA拮抗天然免疫反应的功能鉴定ifn-i在宿主应对病原感染过程中发挥重要功能。本研究首先对TMUV-sfRNA能否抑制ifn-i天然免疫反应进行分析,TMUV-sfRNA体外转录体用于在DEF细胞和HEK293细胞中过表达,检测到TMUV-sfRNA能够显著抑制TMUV及Poly(i:C)诱导的ifn-β表达水平及干扰素调控因子3(interferon regulation factor 3,iRF3)的入核水平。由于发挥抗病毒效应的是iSGs,为进一步验证上述结果,对过表达TMUV-sfRNA的细胞应用一定剂量的Poly(i:C)刺激,荧光定量PCR结果显示,TMUV-sfRNA过表达显著降低了iSGs(iSG15、iSG56、MX1和OAS1)的转录水平。以上结果证实,TMUV-sfRNA拮抗ifn-i天然免疫反应。作为病毒重要的毒力因子,先前的研究证明黄病毒sfRNA能够影响病毒致病性及基因组复制。为进一步验证TMUV-sfRNA对TMUV基因组复制的影响,本研究应用转染将sfRNA体外转录体在细胞中过表达,随后感染一定剂量的TMUV以改变sfRNA和g RNA的摩尔比,应用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,iFA)和荧光定量PCR检测TMUV的增殖情况。结果表明TMUV-sfRNA能够在宿主细胞中显著促进TMUV增殖及蛋白表达。3.与TMUV-sfRNA结合的宿主蛋白的筛选和功能验证已有报道显示,TRiM25在内的多个宿主蛋白与黄病毒sfRNA结合并且参与了病毒拮抗宿主天然免疫的进程。本研究中,TMUV-sfRNA添加生物素标记后与胞浆蛋白孵育,应用RNA-pulldown技术分离与TMUV-sfRNA结合的宿主蛋白。与对照组相比,质谱分析结果表明共有560个蛋白与TMUV-sfRNA相结合,从ifn-i天然免疫角度出发,经过筛选分析,选择DDX56进行深入探究。为进一步验证DDX56与TMUV-sfRNA的相互作用,应用RNA-蛋白质免疫共沉淀(RNA immunopreci pitation,RiP)技术进行验证,q PCR结果表明DDX56能够特异性结合TMUV-sfRNA。随后通过构建DDX56的真核表达质粒来探究其对TMUV基因组复制的影响,荧光定量PCR检测结果表明DDX56能显著促进TMUV基因组的复制。相关研究表明DDX56能够抑制iRF3入核,以此来发挥抑制天然免疫的功能。核质分离试验表明DDX56在生理状态下主要定位于细胞核中,TMUV-sfRNA能够增强DDX56在细胞质中的积累。使用靶向DDX56的si RNA降低蛋白的表达水平,结果表明在DDX56蛋白表达受干扰的细胞中TMUV-sfRNA对iR

关键词：坦布苏病毒 sf RNA RNA pulldown ifn-i天然免疫应答 DDX56

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