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蜡样芽孢杆菌ColR75E胶原酶的表达、纯化及酶学性质研究

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中国生物工程杂志 2015年第10期35卷 44-52页

作者：张西轩李晔王亚航杜康龙张真阮海华天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点实验室天津300134

目的：为了进一步了解蜡样芽孢杆菌R75E胶原酶colR75E的特性，在大肠杆菌原核表达系统中表达colR75E胶原酶，并对表达的重组胶原酶进行纯化以及酶学性质研究。方法：以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板采用PCR法获得胶原酶cozR75E基因... 详细信息

目的：为了进一步了解蜡样芽孢杆菌R75E胶原酶colR75E的特性，在大肠杆菌原核表达系统中表达colR75E胶原酶，并对表达的重组胶原酶进行纯化以及酶学性质研究。方法：以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板采用PCR法获得胶原酶cozR75E基因，构建pET28a／colR75E重组质粒，并在大肠杆菌B121（DE3）中进行诱导表达，利用Ni—NTA纯化的方式获得高纯度ColR75E胶原酶，利用胶原酶谱、胶原酶活力测定、i型胶原蛋白降解产物电泳检测等方式对ColR75E胶原酶的酶学特性进行分析。结果：通过Ni-NTA纯化获得的蛋白经胶原酶谱、i型胶原蛋白降解产物的检测时均表现出胶原蛋白的降解能力。在标准条件下测得其比活力为3．62U／mg，Km为25．55μmol／L（2．93mg／ml），Vmax为5．71μmol／（mg·min）。ColR75E胶原酶的最适反应温度为45℃，最佳反应pH为8．0。此外，ColR75E胶原酶对于不高于50℃的温度以及pH6．0—8．0的酸碱度范围具有良好的稳定性。ColR75E胶原酶可被Ca2＋激活、但被Zn2＋、Ph2＋、Fe、Mn2＋等金属离子抑制，抑制能力依次为Pbn〉Znn〉Fe2＋〉Mn2＋。ColR75E胶原酶对EDTA和EGTA的高敏感性进一步证实了该胶原酶为一种金属蛋白酶。结论：利用大肠杆菌原核表达系统获得高纯度高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶是可行的，为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域中奠定了理论基础。

关键词：蜡样芽孢杆菌胶原酶 i型胶原蛋白酶学性质

蜡样芽孢杆菌胶原酶基因colR75E在毕赤酵母中的重组表达

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微生物学通报 2017年第4期44卷 807-817页

作者：张真李晔张西轩胡双艳阮海华天津市食品生物技术重点实验室天津商业大学生物技术与食品科学学院天津300134

【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PiCZαA/col R75E重组质... 详细信息

【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PiCZαA/col R75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化。将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组Col R75E胶原酶。利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、i型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶Col R75E的活性及底物特异性进行分析。【结果】毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶Col R75E的条件为p H 6.0,甲醇终浓度为2.5%,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及i型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95%,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg。该酶对i型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性。【结论】利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础。

关键词：蜡样芽孢杆菌胶原酶毕赤酵母 i型胶原蛋白

Pi3K/CTGF信号通路在TGF-β1诱导A549细胞表达collagen Ⅰ过程中的作用

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中国病理生理杂志 2017年第3期33卷 489-494页

作者：应赵建黄晓敏余垭妮林晓晓陈晶李文君董年陈成水温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科浙江温州325000

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/结缔组织生长因子(Pi3K/CTGF)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺腺癌A549细胞表达i型胶原蛋白(collagen i)过程中的分子机制。方法:体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激,观察CTGF和collagen i的mRNA和... 详细信息

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/结缔组织生长因子(Pi3K/CTGF)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺腺癌A549细胞表达i型胶原蛋白(collagen i)过程中的分子机制。方法:体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激,观察CTGF和collagen i的mRNA和蛋白表达及Pi3K信号通路的活化;Pi3K抑制剂LY294002预先处理A549细胞后,观察TGF-β1刺激下CTGF和collagen i mRNA和蛋白表达的变化;CTGF特异性si RNA干扰A549细胞中CTGF的表达后,观察TGF-β1刺激下collagen i mRNA和蛋白表达的变化和Pi3K信号通路的活化。结果:TGF-β1可以诱导A549细胞中CTGF和collagen i的mRNA和蛋白表达以及Pi3K信号通路的活化;Pi3K特异性抑制剂LY294002可以部分逆转TGF-β1诱导的A549细胞中CTGF和Collagen i mRNA和蛋白表达的升高。干扰CTGF可以降低TGF-β1诱导的A549细胞collagen i mRNA和蛋白表达,而不影响Pi3K信号通路的活化。结论:CTGF是TGF-β1/Pi3K信号通路调控的即刻早期反应效应蛋白,参与了TGF-β1诱导的A549细胞中collagen i表达。

关键词：转化生长因子β1 i型胶原蛋白结缔组织生长因子

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基于三维打印骨支架制备及其性能

化工进展 2013年第12期32卷 2940-2945页

作者：汪焰恩潘飞龙杨明明西北工业大学机电学院陕西西安710072

利用三维打印(3DP)成型技术制备了羟基磷灰石(HAP)支架与混合壳聚糖(CS)的HAP-CS复合支架,并用Ⅰ型胶原蛋白(Collagen TypeⅠ)对HAP-CS支架进行了改性处理;通过抗压强度实验、孔隙率测定、微观形貌观察、亲水性及碱性磷酸酶(ALP)活性检... 详细信息

利用三维打印(3DP)成型技术制备了羟基磷灰石(HAP)支架与混合壳聚糖(CS)的HAP-CS复合支架,并用Ⅰ型胶原蛋白(Collagen TypeⅠ)对HAP-CS支架进行了改性处理;通过抗压强度实验、孔隙率测定、微观形貌观察、亲水性及碱性磷酸酶(ALP)活性检测实验研究了所制备支架性能。结果表明添加CS可提高HAP支架抗压强度74.5%,但未降低支架孔隙率;经Collagen Type i改性的HAP-CS支架的亲水性有显著提高,ALP活性检测结果显示Collagen TypeⅠ可提高细胞骨化能力。综上,本研究所制备的HAP-CS改性支架具有良好的性能及生物活性,可用于骨缺损修复研究。

关键词：三维打印支架壳聚糖 i型胶原蛋白

极低频电磁场作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞的分子病理改变

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中华实验眼科杂志 2012年第5期30卷 403-407页

作者：王洁崔杰锋朱煌赵立全冯婕妤叶胜龙上海交通大学医学院附属新华医院眼科 200092 复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032

背景极低频电磁辐射产生的热效应与人类癌症的关系及其对眼表的影响已有较多研究。但眼球暴露于极低频电磁场（***）下是否会导致巩膜的病理改变，从而影响近视的发生、发展目前鲜见报道。目的研究ELF—EMFs作用下人胚胎眼巩膜成纤维细... 详细信息

背景极低频电磁辐射产生的热效应与人类癌症的关系及其对眼表的影响已有较多研究。但眼球暴露于极低频电磁场（***）下是否会导致巩膜的病理改变，从而影响近视的发生、发展目前鲜见报道。目的研究ELF—EMFs作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞（HFSFs）的分子病理改变及其在近视发生发展中的可能机制。方法对HFSFs进行体外培养和传代，根据细胞是否暴露于50Hz电磁场分为暴露组和对照组，应用实时定量聚合酶链反应（real—timePCR）法检测不同磁场强度（0、0．1、0．2、0．5、1．0mT）、不同暴露时间（0、6、12、24、36、48h）下HFSFs中i型胶原蛋白（COL1A1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）的基因表达水平变化，同时应用CCK18法检测两组HFSFs的细胞增生情况，并以细胞免疫荧光法对HFSFs中COL1A1和MMP-2蛋白的表达进行确认。结果与对照组相比，暴露组在磁场强度0．2mT下作用6h可见HFSFs中COL1A1mRNA的表达下调，差异有统计学意义（对照组：0．099±0．008，暴露组：0．050±0．004；P=0．009），且表达量随着磁场强度的增加而减少；在磁场强度O．1mT下暴露24h，HFSFs细胞中的MMP-2mRNA表达上调，差异有统计学意义（对照组：0．009＋0．001，暴露组：0．018±0．003；P=0．038），并随着暴露时间的延长表达增强。磁场强度0．2mT下暴露24h，HFSFs细胞增生的吸光度（A450）值明显下降，差异有统计学意义（P=0．009）；免疫荧光分析也显示暴露组HFSFs细胞中COL1A1表达下调，MMP-2表达上调。结论ELF—EMFs暴露可在一定范围内影响体外培养的HFSFs的增生及COL1A1的合成，可能是诱导巩膜发生病理性重塑进而导致近视发生、发展的危险因素之一。

关键词：极低频电磁场人胚胎眼巩膜成纤维细胞近视 i型胶原蛋白基质金属蛋白酶2

两个成骨不全家系的COL1A1基因突变筛查及临床特征分析

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眼科 2019年第4期28卷 273-279页

作者：冯丙岂刘旭阳何芬李丹丽张达人赵林樊宁暨南大学第二临床医学院深圳市眼科医院深圳眼科学重点实验室518040 厦门大学附属厦门眼科中心 361005 四川凉山州第二人民医院 615000

目的分析2个成骨不全(osteogenesis imperfecta,Oi)家系的临床特征和分子遗传学特点。设计回顾性病例系列。研究对象2个分别位于四川和广东的汉族成骨不全家系成员共45人,其中家系1本课题组曾在GMR杂志报道,作者对其进行了5年的追踪观... 详细信息

目的分析2个成骨不全(osteogenesis imperfecta,Oi)家系的临床特征和分子遗传学特点。设计回顾性病例系列。研究对象2个分别位于四川和广东的汉族成骨不全家系成员共45人,其中家系1本课题组曾在GMR杂志报道,作者对其进行了5年的追踪观察。方法收集家系成员的详细临床资料并进行眼部和全身检查,采集家系患者和正常成员的外周血进行基因组DNA提取,筛选疾病相关基因序列改变,在家系成员和正常个体中进行验证分析,确定致病基因和突变位点,分析其与患者临床特征的关系,并对两个家系进行对比分析。主要指标既往病史、视力、角膜厚度、眼前节和眼后节检查、听力检测、X线检查以及基因测序结果。结果2个家系分别诊断为Ⅰ型和Ⅳ型,均符合常染色体显性遗传模式,临床表现的共同特征是巩膜为蓝色、角膜厚度薄、反复非强力骨折、听力下降、脊柱畸形,不同之处在于家系2患者还合并身材矮小、牙本质发育不全,全身骨骼畸形更为明显。分子遗传学分析发现,家系1为COL1A1基因第33号外显子杂合突变(c.2329delG),引起第777位密码子移码突变(***777Profs*330),造成COL1A1蛋白合成缺陷;家系2为COL1A1基因第10号外显子杂合突变(c.725G>T),引起第242位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为缬氨酸(Val)(***242Val);家系1突变为本课题组发现的突变并已经报道,家系2为COL1A1基因新突变。结论本研究中2个Oi家系分别是由于COL1A1基因c.2329delG和c.725G>T突变导致,本研究结果丰富了COL1A1基因突变谱,有助于Oi基因型与临床表型关系的研究。

关键词：成骨不全 7基因 i型胶原蛋白分子遗传学

微波辐射减轻瘢痕形成的疗效及其作用机制研究

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中华物理医学与康复杂志 2017年第1期39卷 1-4页

作者：李雁婷沈晓艳李韵曹曼林上海市第六人民医院康复科上海200233

目的探讨微波辐射对原代培养的人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞增殖活性的影响，进而分析微波辐射后成纤维细胞的胶原蛋白合成的变化及相关信号的激活情况。方法将瘢痕成纤维细胞分为对照组（自然生长无任何处理）、10mW／cm2微波辐射组和2... 详细信息

目的探讨微波辐射对原代培养的人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞增殖活性的影响，进而分析微波辐射后成纤维细胞的胶原蛋白合成的变化及相关信号的激活情况。方法将瘢痕成纤维细胞分为对照组（自然生长无任何处理）、10mW／cm2微波辐射组和20mW／cm2微波辐射组，然后再根据辐射时间，将10mW／cm2微波辐射组和20mW／cm2微波辐射组分为辐射5min、15min、30min各3个亚组。采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT）测定成纤维细胞的生长情况。采用Western blot方法分析微波辐射后对细胞i型胶原蛋白表达水平的影响。采用抗磷酸化形式的c—Jun氨基末端激酶（JNK）抗体，通过Western blot方法观察微波辐射后瘢痕来源的成纤维细胞JNK磷酸化（pJNK）的情况。结果辐射后，10mW／cm2微波辐射组3个亚组的瘢痕成纤维细胞增殖率与对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；20mW／cm2微波辐射组3个亚组的瘢痕成纤维细胞增殖率明显受到抑制，与对照组和10mW／cm2微波辐射组相同时间点比较，差异均有统计学意义（P〈0．05），且20mW／cm2微波辐射组各时间点间两两比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。辐射后，20mW／cm2微波辐射组的瘢痕成纤维细胞中i型胶原的表达量显著降低，其降低程度随着微波辐射时间的延长而增加。辐射后，20mW／cm2微波辐射组各时间点的瘢痕成纤维细胞内JNK信号通路的激活水平均显著上调，且分别与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论20mW／cm2强度的微波辐射可显著抑制瘢痕成纤维细胞的增殖，且辐射时间越长抑制效果越明显；20mW／cm2强度的微波辐射可显著抑制胶原的表达，并通过激活JNK信号转导通路而起到减轻瘢痕形成的作用。

关键词：瘢痕成纤维细胞微波 i型胶原蛋白 c—Jun氨基末端激酶

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龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的机制研究

中华中医药学刊 2017年第4期35卷 1008-1013,I0013页

作者：钱哲王建伟尹恒谢斌袁明阳南京中医药大学第一临床医学院江苏南京210023 南京中医药大学附属无锡市中医医院江苏无锡214071

目的:研究龟鹿二仙胶对成骨细胞i型胶原及TGF-β表达的影响,探索龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的机制。方法:SD大鼠随机分为对照组、龟鹿二仙胶低剂量组、中剂量组、高剂量组、骨化三醇组,每天灌胃1次,持续7 d,末次给药2 h后腹主动脉采血,... 详细信息

目的:研究龟鹿二仙胶对成骨细胞i型胶原及TGF-β表达的影响,探索龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的机制。方法:SD大鼠随机分为对照组、龟鹿二仙胶低剂量组、中剂量组、高剂量组、骨化三醇组,每天灌胃1次,持续7 d,末次给药2 h后腹主动脉采血,制成含药血清作用于大鼠成骨样细胞ROS17_2.8株。用MTT法及活细胞形态观察含药血清对成骨细胞增殖及凋亡的影响。用各组含药血清条件培养基培养成骨细胞,应用Western Blot法检测各组成骨细胞i型胶原及TGF-β蛋白表达水平,采用RT-PCR法检测各组成骨细胞i型胶原及TGF-βmRNA的表达。结果:(1)MTT结果显示:龟鹿二仙胶各组的成骨细胞无明显增殖。骨化三醇组的成骨细胞有明显增值(P0.05);骨化三醇组TGF-β1及TGF-β2mRNA水平无明显变化(P>0.05);龟鹿二仙胶各组TGF-β1及TGF-β2mRNA水平均有增加(P0.05)。(3)Western blot结果提示:第24 h,龟鹿二仙胶高剂量组能使成骨细胞COL1A1及COL1A2蛋白合成增加(P蛋白合成增加(P0.05);第24、48 h,骨化三醇组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成无明显变化(P>0.05);在24 h,龟鹿二仙胶高剂量组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成有显著增强(P蛋白合成无明显变化(P>0.05);48 h,龟鹿二仙胶各组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成增加(P0.05)。结论:龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症机制可能通过调节细胞因子TGF-β,促进i型胶原的表达,为探讨中药促胶原形成治疗骨质疏松提供细胞及分子生物学依据。

关键词：龟鹿二仙胶成骨细胞 i型胶原蛋白 TGF-β

推拿[扌衮]法对骨骼肌钝挫伤家兔模型损伤后炎症及纤维化的影响

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中国临床解剖学杂志 2024年第2期42卷 191-195页

作者：阮磊黄博王兰兰薛惠天孙梦龙段苗苗彭亮湖南中医药大学针灸推拿与康复学院长沙410208

目的探讨推拿[扌衮]法对家兔骨骼肌钝挫伤后相关纤维蛋白表达的影响,以及对骨骼肌钝挫伤修复的作用机制。方法健康成年新西兰兔15只,随机分为空白组(A)、模型组(B)和治疗(C)组,每组5只。使用自制改良重力锤打击装置对模型组和治疗组... 详细信息

目的探讨推拿[扌衮]法对家兔骨骼肌钝挫伤后相关纤维蛋白表达的影响,以及对骨骼肌钝挫伤修复的作用机制。方法健康成年新西兰兔15只,随机分为空白组(A)、模型组(B)和治疗(C)组,每组5只。使用自制改良重力锤打击装置对模型组和治疗组建立骨骼肌钝挫伤模型,治疗组家兔于造模成功后7 d给予推拿[扌衮]法干预,频率140次/min,2次/d,3 min/次,共治疗3 d。干预结束后1 d进行取材。HE和Masson染色观察兔股四头肌病理改变;Western-blot检测各组股四头肌基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、特异性抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TiMP-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及i型胶原蛋白(i collagen,COL-i)表达。结果空白组肌组织结构规整;模型组肌组织形态迥异,边界模糊,间隙显著增宽,炎细胞浸润显著,四周胶原纤维生成增加;治疗组肌组织结构相对完整,间隙缩小,可见少量炎细胞浸润与胶原纤维生成,其病理修复程度显著优于模型组。检测家兔股四头肌MMP-9、TiMP-1、TGF-β1、COL-i表达,与空白组相比,模型组与治疗组明显增加(PiMP-1、TGF-β1及COL-i表达量有关。

关键词：推拿?法骨骼肌钝挫伤基质金属蛋白酶-9 基质金属蛋白酶抑制剂-1 转化生长因子-β1 i型胶原蛋白