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禽副黏病毒6型hubei株分离鉴定与SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

禽副黏病毒6型Hubei株分离鉴定与SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方...

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作者：陶志延边大学

学位级别：硕士

APMV-6是单股负链病毒目(Mononegavirales),副黏病毒科(Paramyxovirida e),副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)成员。流行病学调查发现多种水禽体内可分离到APMV-6毒株,也可在试验中使用9-11日龄的鸡胚繁殖病毒。... 详细信息

APMV-6是单股负链病毒目(Mononegavirales),副黏病毒科(Paramyxovirida e),副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)成员。流行病学调查发现多种水禽体内可分离到APMV-6毒株,也可在试验中使用9-11日龄的鸡胚繁殖病毒。APMV-6可引起禽类出现轻微的呼吸道症状,也可导致其产蛋量下降。国内国外对于禽副黏病毒6型的研究较少,目前在GenBank中APMV-6毒株完整序列只有9条,所以通过本试验分析APMV-6的流行规律、生物学特性以及建立一种针对APMV-6的高效检测方法是很有必要的。首先对中国5个地区的样本采集,对样本进行病毒培养后利用普通PCR进行检测,对阳性样品测序验证阳性样品为APMV-6后,对其进行基因组扩增并进行序列分析。然后对鉴定为APMV-6的样品进行传代,并对每代病毒进行红细胞凝集试验验证其血凝性。最后建立一种SYBR Green I荧光定量PCR检测方法并对方法进行优化,评价其敏感度、特异性、重复性等指标。本试验采集11 368份样本分离到1株APMV-6并命名为hubei株。hubei株基因组全长为16 236bp,符合禽副黏病毒的六碱基原则,对hubei株进行遗传进化分析,属于基因1型,1a亚型。对hubei株进行血凝试验时,发现hubei株在F1,F2两代没有发生血凝现象,然而在F3代发生了血凝现象,此现象并不符合禽副黏病毒具有血凝性的生物学特征。根据GenBank发表的APMV-6参考毒株(登录号:KF267717)M基因序列,利用Oligo7设计合成1对引物,以重组阳性质粒为标准品,建立了 APMV-6 SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法经优化后线性关系良好,标准曲线R2=0.998。本方法敏感度高,特异性强,重复性好,最低检出拷贝数为2.78×102copies/μL,与NDV、APMV-4、APMV-13和GPV不发生特异性反应,比常规检测方法检出率高18%。本试验成功分离到APMV-6 hubei株,核苷酸序列全长为16 236bp;并建立了针对禽副黏病毒6型的荧光定量PCR检测方法。

关键词：禽副黏病毒6型分离鉴定 hubei株血凝试验荧光定量PCR

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