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Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing hsp65-hIL-2 fusion protein and its influence on lymphocyte function in mice

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Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2012年第5期5卷 347-351页

作者： Xiao-Qing Guo Yan-Ming Wei Bo Yu Animal Medical College Gansu Agricultural University Affiliated Hospital of Gansu College of Traditional Chinese Medicine

Objective:To coastruct a strain of recombinant Mycobacterium smegmatis expressing the heat shock protein 65(hsp65) and human interleukin 2(IL-2) fusion protein(rMS-hsp65/IL-2) and to explore the effect of this construct on lymphocyte function in ***:The fusion gene encoding hsp65-hIL-2 was cloned into shuttle vector *** recombinant plasmid pSMT3- hsp65-hIL-2 was transferred to Mycobacterium smegmatis by *** clones were selected by hygromycin and identified by *** expression of fusion protein hsp65- hIL-2 was verified using indirect immunofluorescence *** were immunized for two times by subcutaneously injection with 1×10~6 CFU rMS-hsp65/IL-2 at a three-week *** weeks after the second immunization,mice were sacrificed and the serum samples were collected for determination of anli-hsp65 specific *** lymphocytes were isolated and treated with the rMS-hsp65/IL-2 to determine lymphocytic proliferation activity by MTT ***-γand IL-2 in the medium of the treated cells were also determined by ***:Successful construction of rMS-hsp65/IL-2 was verified by PCR and immunofluorescence *** to the splenic lymphocytes isolated from mice immunized with Bacille Calmette-Guerin or mice immunized with Mycobacterium smegmatis alone,the splenic lymphocytes isolated from mice immunized with rMS-hsp65/IL-2 showed a marked increase in the proliferation of lymphocytes, together with an increased production of important cytokines such as IFN- 7 and IL-2. Conclusions:rMS-hsp65/IL-2 markedly enhances lymphocyte ***,the fusion protein generated by rMS-hsp65/lL-2 may be of potential value in generating an effective vaccine against tuberculosis.

关键词： Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium smegmatis hsp65 IL-2 Fusion protein Lymphocytes Mice

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hsp65基因PCR-限制性片断长度多态性分析毛细管电泳技术鉴定分枝杆菌的初步研究

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卫生研究 2004年第3期33卷 297-299页

作者：王国庆张朝武黎源倩周颖四川大学华西公共卫生学院成都610041

目的　建立hsp6 5PCR RFLP毛细管电泳快速鉴定分枝杆菌的方法。方法　采用PCR扩增分枝杆菌 6 5 kDa热休克蛋白 (hsp6 5 )基因的一个约 4 4 0bp片段 ,扩增产物分别经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后 ,用毛细管电泳激光诱导荧光检测酶... 详细信息

目的　建立hsp6 5PCR RFLP毛细管电泳快速鉴定分枝杆菌的方法。方法　采用PCR扩增分枝杆菌 6 5 kDa热休克蛋白 (hsp6 5 )基因的一个约 4 4 0bp片段 ,扩增产物分别经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后 ,用毛细管电泳激光诱导荧光检测酶切片段。结果　试验的全部 7种分枝杆菌都有各自独特的酶切图谱模式 ,几乎所有酶切片段都能很好地分离。结论　该方法用于分枝杆菌种水平的鉴定具有准确度、分辨率和灵敏度高的优点。

关键词：分枝杆菌 hsp65 毛细管电泳

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结核杆菌hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第1期21卷 13-16页

作者：肖凌魏雅稚夏飞刘胜武武汉大学医学院免疫学系湖北武汉430071

目的: 构建结核杆菌H37Rv株hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGhsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP... 详细信息

目的: 构建结核杆菌H37Rv株hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGhsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGhsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测hsp65mRNA的表达。以pEGhsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGhsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。

关键词：结核杆菌 hsp65 增强型绿色荧光蛋白树突状细胞

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Ub Combination Enhanced Cellular Immune Response Elicited by hsp65 DNA Vaccine against <i>Mycobacterium tuberculosis</i>

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World Journal of Vaccines 2013年第3期3卷 89-97页

作者： Qingmin Wang Chengxiang Lei Qiuhong Liu The Division of Aviation Medicine the Naval Medical Research Institute Shanghai China.

This study observed the immune response induced by a hsp65 DNA vaccine fused with UbGR against Mycobacterium tuberculosis. BALB/c mice were inoculated with hsp65 DNA vaccine, UbGR-fused hsp65 DNA vaccine (Ub-GR-hsp65) and blank vector respectively. hsp65 DNA vaccine elicited a Thl-polarized immune response. The Thl-type cytokine (IFN-γ) and proliferative T cell responses from spleen were improved significantly in UbGR-hsp65 group, compared with those in hsp65 DNA vaccine group. Furthermore, this fusion DNA vaccine also led to an increased ratio of IgG2ato IgGl and the cytotoxicity of T cells. IFN-γ intracellular staining of splenocytes indicated that UbGR-hsp65 fusion DNA vaccine could activate CD4+ and CD8+ T cells, with much higher CD8+ T cells. Thus, this study demonstrated that the UbGR fusion could improve hsp65-specific cellular immune responses, which is helpful to protect against TB infection.

关键词： Mycobacterium tuberculosis hsp65 Ubiquitin Immune Response

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结核分枝杆菌hsp65-Ag85B、hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究

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免疫学杂志 2020年第2期36卷 109-115页

作者：张真赵玲娜申梦王希良杨鹏辉包金风内蒙古医科大学基础医学院呼和浩特010059 中国人民解放军总医院第五医学中心北京100039 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所/病原微生物与生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建结核分枝杆菌hsp65-Ag85B、hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取*** H37Rv的Ag85B、ESAT6和hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-hsp65... 详细信息

目的构建结核分枝杆菌hsp65-Ag85B、hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取*** H37Rv的Ag85B、ESAT6和hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-hsp65-Ag85B和PVAX1-hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果hsp65-Ag85B、hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,hsp65-Ag85B、hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且hsp65-Ag85B优于hsp65-ESAT6。结论hsp65-Ag85B、hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于hsp65-ESAT6,为新型结核DNA疫苗研制提供了实验依据。

关键词： DNA疫苗 Ag85B ESAT6 hsp65 分枝杆菌

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结核分枝杆菌hsp65的表达、纯化与鉴定

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中国人兽共患病学报 2008年第6期24卷 535-538页

作者：席丽师长宏靳亚平张廷芬赵勇岳晨莉西北农林科技大学杨陵712100 第四军医大学实验动物研究中心西安710032

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后... 详细信息

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 hsp65 表达纯化

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结核分枝杆菌融合基因hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达(英文)

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中国组织工程研究与临床康复 2007年第29期11卷 5836-5839页

作者：李君武黄泽棋姚翠婵周曙光李晓栋宋东黄清华暨南大学医学院微生物免疫学教研室广东省广州市510632

背景:hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核... 详细信息

背景:hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGhsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGhsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGhsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGhsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGhsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGhsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGhsp65为6.4kb,融合质粒pEGhsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%。未转染的Hela细胞则无荧光表达。④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的hsp65与ESAT-6蛋白。结论:采用hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因hsp65-Esat6荧光真核表达质粒。

关键词：结核分枝杆菌 hsp65 Esat6 融合基因 DNA疫苗

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结核分支杆菌hsp65蛋白在真核细胞中的瞬时表达

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中国免疫学杂志 2005年第3期21卷 216-217页

作者：居巍刘君炎佘应龙曹飞武汉大学医学院免疫学系武汉430071 武汉大学生命科学院医学病毒学实验室武汉430072

近年来由于结核病在全球公共卫生政策中被严重忽视,加上移民的大量增加,HIV与结核杆菌伴发感染以及多重耐药菌株产生等因素,导致全球结核病疫情再度严峻,结核病的防治工作面临新的挑战[1].我国在全世界22个结核病大国中位居第二,每年死... 详细信息

近年来由于结核病在全球公共卫生政策中被严重忽视,加上移民的大量增加,HIV与结核杆菌伴发感染以及多重耐药菌株产生等因素,导致全球结核病疫情再度严峻,结核病的防治工作面临新的挑战[1].我国在全世界22个结核病大国中位居第二,每年死于结核病的人数高居各类传染病之首,因此研发新型有效抗结核病疫苗的工作迫在眉睫.我们构建了结核分支杆菌热休克蛋白(hsp)65的真核表达质粒pchsp65[2],研究它在真核细胞-HeLa细胞中的表达情况,为进一步研究结核病DNA疫苗奠定基础.……

关键词：抗结核病 hsp65 结核分支杆菌真核细胞瞬时表达蛋白 HIV 多重耐药菌株疫苗防治工作

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hsp65-HER2对HER2～+和HER2～-肿瘤细胞的免疫选择

HSP65-HER2对HER2～+和HER2～-肿瘤细胞的免疫选择

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作者：王俊英吉林大学

学位级别：硕士

HER2蛋白(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达与乳腺癌的发生、转移和预后密切相关。正常情况下,HER2在乳腺上皮细胞和其他正常细胞有低水平表达。约有25-30%的乳腺癌患者的肿瘤细胞高水平表达HER2,此外,高表达HER2... 详细信息

HER2蛋白(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达与乳腺癌的发生、转移和预后密切相关。正常情况下,HER2在乳腺上皮细胞和其他正常细胞有低水平表达。约有25-30%的乳腺癌患者的肿瘤细胞高水平表达HER2,此外,高表达HER2的乳腺癌患者易产生耐药性并多有不良的预后。因此,HER2可能成为乳腺癌免疫治疗的靶点。结核分支杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,hsp65)具有分子伴侣及分子佐剂的作用。在抗肿瘤的免疫应答过程中,hsp65可激活机体的非特异性免疫系统,并可引导与其形成复合物或与之融合的抗原肽在树突状细胞内经MHC I类途径加工递呈,从而激活抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)。我们将hsp65与HER2的表位肽基因相连接,并在大肠杆菌中成功地表达并纯化了hsp65-HER2多表位融合蛋白(hsp65-HER2)。采用本室已转染的表达HER2的肿瘤细胞HER2+/B16(HER2+表达率为70.1%)接种小鼠,观察融合蛋白hsp65-HER2在小鼠体内的抑瘤效果。结果发现,hsp65-HER2诱生的特异性CTL能选择性地清除HER2+的肿瘤细胞。这项工作为进一步研究hsp65-HER2的抗肿瘤作用提供了实验基础。

关键词： hsp65 HER2 免疫选择

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重组卡介苗hsp65抑制小鼠移植黑色素瘤的初步药效学研究

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中国生物工程杂志 2012年第12期32卷 47-51页

作者：谢燕飞陈檬彭淑红汤啸天舒青龙左爱仁曹荣月江西中医学院基础医学院南昌330004 中国药科大学生命科学与技术学院微基因药物实验室南京210009

观察卡介苗来源的热休克蛋白hsp65对小鼠移植黑色素瘤的抑制作用并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组hsp65蛋白,与弗氏佐剂联合给药C57BL/6J小鼠。分别设计了两组免疫方案,一组于肿瘤细胞接种前免疫3次,另一组于... 详细信息

观察卡介苗来源的热休克蛋白hsp65对小鼠移植黑色素瘤的抑制作用并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组hsp65蛋白,与弗氏佐剂联合给药C57BL/6J小鼠。分别设计了两组免疫方案,一组于肿瘤细胞接种前免疫3次,另一组于肿瘤细胞接种前免疫7次。结果在免疫3次的情况下,虽然也能激发较高的特异性抗hsp65抗体,但抑瘤效果不明显(抑瘤率14.2%);增加免疫次数到7次后,抑瘤率高达73.2%,效果显著。经肿瘤组织病理切片发现,增加免疫次数导致肿瘤组织中灶性坏死增加,淋巴细胞浸润增加,且肿瘤细胞病理性核分裂相减少,提示了该疫苗作用的可能机制。

关键词： hsp65 黑色素瘤

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