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中华结核和呼吸杂志 2007年第6期30卷 456-458页

作者：张廷芬师长宏第四军医大学实验动物研究中心西安710032

hsp16.3是由结核分枝杆菌（***，MTB）hspX基因（Rv2031c、acr）编码的蛋白，最初被认为是免疫显性抗原，后来被确认是一个重要的膜抗原，它的表达与MTB的休眠密切相关。

关键词： hsp16.3 生物学特性结核病结核分枝杆菌免疫显性抗原 pX基因膜抗原 MTB

A preliminary study on functional domains of small heat shock protein hsp16.3

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Progress in Natural Science:Materials International 2004年第1期 22-26页

作者： CHANG Yong, LI Xuemei and RAO Zihe*(Laboratory of Structural Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China) Laboratory of Structural Biology Tsinghua University Beijing 100084 China

hsp16.3, the small heat shock protein (shsp) from Mycobacterium tuberculosis , was originally identified as an immunodominant antigen,which possesses three functional domains typical of shsp family, namely the N terminal hydrophobic region, α crystallin domain and a short non conserved C terminal extension. To further understand the functional assignment of these independent regions, the three functional domains of hsp16.3 were defined and the two N or C terminal truncated hsp16.3 remnants were successfully cloned, expressed and purified. In the far and near circular dichroism analysis, the results showed that these remnants expressed similar secondary and tertiary structures to that of wild type protein. During the reassembly of wild type nonamer, the C terminal truncated remnant could interact with the wild type protein to form hetero oligomers. When trypsin is used to digest the wild type hsp16.3, its α crystallin domain could resist such degradation. Taken together, these results indicate that the stable secondary and tertiary structures of hsp16.3 are mainly kept by its α crystallin domain.

关键词： small heat shock protein(shsp) hsp16.3 α crystallin domain reassembly

Leu122对hsp16.3组装过程中亚基相互作用的影响

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中国生物化学与分子生物学报 2002年第1期18卷 99-104页

作者：黄素芳古良才毛启龙昌增益清华大学生命科学与技术系

小分子热休克蛋白是种类最多的热休克蛋白家族 ,它们均以寡聚体的形式存在 .研究表明 ,来自结核杆菌的小分子热休克蛋白hsp16 3是以 3个三聚体的形式存在的九聚体 .为了探讨hsp16 3体外组装过程中的亚基相互作用和识别 ,利用野生型hsp... 详细信息

小分子热休克蛋白是种类最多的热休克蛋白家族 ,它们均以寡聚体的形式存在 .研究表明 ,来自结核杆菌的小分子热休克蛋白hsp16 3是以 3个三聚体的形式存在的九聚体 .为了探讨hsp16 3体外组装过程中的亚基相互作用和识别 ,利用野生型hsp16 3及其L12 2A突变体蛋白为模型 ,采用高效液相分子筛层析、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和脲梯度凝胶电泳等方法进行研究 .结果表明 ,hsp16 3在体外能自发地再组装成九聚体 .12 2位的亮氨酸残基对hsp16 3体外再组装过程中的亚基相互作用有重要的影响 ,并且在hsp16 3的组装过程中 ,亚基之间的相互识别是高度灵敏和特异的 ,野生型蛋白的亚基和L12 2A突变体蛋白的亚基并不能形成杂合体。

关键词：小分子热休克蛋白组装杂合中间体亚基相互作用亚基特异性识别 Leu122 hsp16.3

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-hsp16.3的表达、纯化和鉴定

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中国人兽共患病学报 2010年第10期26卷 953-956页

作者：杨巍师长宏赵佐庆赵勇江鹰第四军医大学实验动物中心西安710032 第四军医大学唐都医院实验外科

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-hsp16.3扩增hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进... 详细信息

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-hsp16.3扩增hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。

关键词： Ag85B hsp16.3 融合蛋白原核表达纯化

结核分枝杆菌H37Rv菌株hsp16.3基因缺失突变株的构建与鉴定

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中国人兽共患病学报 2013年第10期29卷 991-995页

作者：田玺择吴芳章乐曹旭东张万江重庆市永川区人民医院重庆402160 石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室石河子832002

目的构建及鉴定结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株hsp16.3基因缺失突变株。方法体外培养结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株,并提取基因组DNA,扩增hsp16.3基因两侧序列,分别插入到pKO质粒载体预定位点中,构建hsp16.3基因置换型打... 详细信息

目的构建及鉴定结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株hsp16.3基因缺失突变株。方法体外培养结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株,并提取基因组DNA,扩增hsp16.3基因两侧序列,分别插入到pKO质粒载体预定位点中,构建hsp16.3基因置换型打靶载体,电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株内,并与其基因组中的hsp16.3基因同源交换,筛选出hsp16.3基因缺失突变株。结果通过卡那霉素筛选和蔗糖反筛选及PCR鉴定,并在含有潮霉素培养基上不能生长的菌株为hsp16.3基因缺失突变株。结论成功构建出结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株hsp16.3基因缺失突变株。

关键词：基因敲除 hsp16.3 结核分枝杆菌 H37Rv

结核分枝杆菌蛋白hsp16.3的基因克隆以及表达

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中国人兽共患病学报 2011年第2期27卷 138-140页

作者：田绿波罗垲炜陈肖潇吕冰樊学军张洋万康林四川国际旅行卫生保健中心成都610041 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的克隆结核分枝杆菌蛋白hsp16.3的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对hsp16.3的基因进行扩增,以pET30a为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。聚丙烯酰... 详细信息

目的克隆结核分枝杆菌蛋白hsp16.3的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对hsp16.3的基因进行扩增,以pET30a为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的hsp16.3重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 hsp16.3 基因克隆

TLR2/4在MTB hsp16.3刺激小鼠巨噬细胞过程中表达及作用的初步探讨

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中国免疫学杂志 2017年第1期33卷 36-40页

作者：李姗姗秦欢刘芊伊徐林张继东冯继红李龙梅泮红飞罗军敏遵义医学院免疫学教研室贵州省免疫分子应用研究工程中心遵义563099

目的:在体外细胞水平,初步探讨TLR2/4在MTB hsp16.3刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞的表达及作用。方法:从BALB/c小鼠的胫腓骨中取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获得骨髓来源的M0型巨噬细胞,流式检测F4/80和CD11b的表达并观察其形态;100 ng/ml MTB ... 详细信息

目的:在体外细胞水平,初步探讨TLR2/4在MTB hsp16.3刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞的表达及作用。方法:从BALB/c小鼠的胫腓骨中取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获得骨髓来源的M0型巨噬细胞,流式检测F4/80和CD11b的表达并观察其形态;100 ng/ml MTB hsp16.3刺激M0巨噬细胞,分别培养0、12、24、36、48、72 h,Real-time PCR检测不同时间点TLR2/4的表达水平;利用RNAi干扰技术沉默巨噬细胞表面的TLR2/4受体,MTB hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0巨噬细胞,分别培养0、12、24、36、48、72 h,Real-time PCR检测不同时间点TLR2/4及Ym-1、Fizz1、IL-10、TNF-α、i NOS、TGF-β细胞因子的表达水平。结果:M0型巨噬细胞在MTB hsp16.3刺激后出现了较短的伪足,沉默TLR2/4的M0型巨噬细胞在MTB hsp16.3刺激后出现了较长伪足;M0巨噬细胞在MTB hsp16.3刺激后高表达TLR2/4。MTB hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0型巨噬细胞,高表达M1型巨噬细胞相关的细胞因子IL-6、TNF-α、i NOS,低表达M2型巨噬细胞相关的细胞因子IL-10、TGF-β、Ym-1、Fizz1。结论:MTB hsp16.3通过TLR2/4促进M0型巨噬细胞向M2型转化,抑制M1型巨噬细胞,这可能参与了MTB躲避巨噬细胞的吞噬过程。

关键词：结核分枝杆菌 Toll样受体 MTB hsp16.3 替代性活化巨噬细胞

结核分枝杆菌hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究

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中国病原生物学杂志 2012年第8期7卷 569-573,I0002页

作者：姚楠董江涛徐芳田玺泽吴芳章乐吴江东张万江石河子大学医学院病理生理学教研室石河子大学"新疆地方与民族高发病"教育部重点实验室新疆石河子832002

目的建立结核分枝杆菌感染RAW264.7株巨噬细胞模型,研究结核分枝杆菌hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。方法分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染RAW264.7巨噬细胞株,于感染后1、3、6及12h,利用激光共聚焦显微... 详细信息

目的建立结核分枝杆菌感染RAW264.7株巨噬细胞模型,研究结核分枝杆菌hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。方法分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染RAW264.7巨噬细胞株,于感染后1、3、6及12h,利用激光共聚焦显微镜鉴定卡介苗及结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染RAW264.7巨噬细胞模型;同时利用流式细胞技术于上述各时间点检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化;利用PCR技术扩增模型目的基因,利用Western blot检测上述各个时间点hsp16.3蛋白表达水平的时相性变化。结果激光共聚焦显微镜下观察到RAW264.7巨噬细胞内有标记MTB16KD的绿色荧光,证实结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型构建成功。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中感染后1、3和12h凋亡率H37Rv感染组与BCG感染组比较差异有统计学意义(Phsp16.3蛋白表达升高,其中感染后1h和3h升高更显著。结论结核分枝杆菌感染可导致巨噬细胞凋亡,感染巨噬细胞的凋亡率与菌株毒力强弱有关,弱毒力结核分枝杆菌感染的巨噬细胞早期凋亡更显著;结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡与结核分枝杆菌表达hsp16.3水平高低有关,在感染早期强毒力结核分枝杆菌hsp16.3表达水平较高。

关键词：结核分枝杆菌H37Rv株 BCG hsp16.3 巨噬细胞凋亡

卡介苗菌株hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

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中国现代医学杂志 2012年第11期22卷 8-13页

作者：田玺择徐芳董江涛姚楠吴芳章乐曹旭东张万江石河子大学医学院病理生理学教研室(石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室) 新疆石河子832002

目的构建卡介苗菌株hsp16.3基因打靶载体。方法体外培养卡介苗菌株并提取基因组DNA,扩增hsp16.3基因两侧序列5'-hsp16.3和3'-hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序... 详细信息

目的构建卡介苗菌株hsp16.3基因打靶载体。方法体外培养卡介苗菌株并提取基因组DNA,扩增hsp16.3基因两侧序列5'-hsp16.3和3'-hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定。结果构建的卡介苗菌株hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因。结论成功构建出卡介苗菌株hsp16.3基因打靶载体。

关键词：基因敲除基因打靶载体 hsp16.3 卡介苗

关于小分子热休克蛋白hsp16.3各功能区作用的初步研究

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自然科学进展 2003年第10期13卷 1099-1103页

作者：常咏李雪梅饶子和清华大学结构生物学实验室北京100084

小分子热休克蛋白hsp16.3是一种存在于结核杆菌中的重要抗原,具有小分子热休克蛋白家族成员典型的3个功能区:N端疏水区,α-crystallin域和C端较短的非保守区.为了进一步研究其各功能区的作用,我们定义了hsp16.3的3个功能区并在大肠杆菌... 详细信息

小分子热休克蛋白hsp16.3是一种存在于结核杆菌中的重要抗原,具有小分子热休克蛋白家族成员典型的3个功能区:N端疏水区,α-crystallin域和C端较短的非保守区.为了进一步研究其各功能区的作用,我们定义了hsp16.3的3个功能区并在大肠杆菌中分别克隆、表达和纯化了N端区或C端区缺失的两个hsp16.3残体蛋白.远紫外和近紫外圆二色谱分析结果显示,残体蛋白表现出与野生型蛋白相似的二级和三级结构.在九聚体野生型蛋白进行亚基重组装时,C端缺失的hsp16.3残体蛋白能与野生型蛋白发生相互作用,形成异源寡聚体.在对野生型蛋白进行胰酶消化时,hsp16.3的α-crystallin域对胰酶的消化具有抵抗能力.所有这些结果显示:在hsp16.3的3个功能区中,α-crystallin域是一个相对独立和稳定的结构单元,它对该蛋白各级结构的维持十分重要.

关键词：小分子热休克蛋白 hsp16.3 功能区 N端疏水区 α—crystallin域 C端非保守区结构