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E2F1转录因子促进宫颈癌细胞增殖并促进CENpM的表达

E2F1转录因子促进宫颈癌细胞增殖并促进CENPM的表达

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作者：金玲艳中国医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:宫颈癌（Cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma,CESC）是常见的妇科恶性肿瘤。在中国,每年有106000例宫颈癌新发病例和48000例因CESC死亡的病例,与印度一起占据了每年全世界宫颈癌病例的... 详细信息

研究背景和目的:宫颈癌（Cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma,CESC）是常见的妇科恶性肿瘤。在中国,每年有106000例宫颈癌新发病例和48000例因CESC死亡的病例,与印度一起占据了每年全世界宫颈癌病例的三分之一。局部性CESC的5年生存率可达92%,然而伴有远处转移的CESC患者5年生存率仅20%。因此,寻找有效而精准的CESC生物标志物及有效的治疗靶点有利于CESC的早期诊断、有效治疗及预后评估。E2F1作为E2F转录因子家族成员之一,是视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma,RB）抑癌蛋白的重要效应分子。低磷酸化的RB蛋白通过与E2F1结合抑制其转录活性,进而维持细胞周期的稳定。99%的宫颈癌由长期感染高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HpV）所导致。HpV DNA整合到宿主（人）基因组导致HpV E6和E7致癌基因过表达。HpV E7致癌蛋白与RB蛋白结合后导致RB蛋白功能性失活而无法抑制E2F1的转录活性,进而激活S期DNA复制所需的E2F1靶基因的转录。这些靶基因的转录有可能通过促进细胞增殖加速CESC的发生。目前,E2F1在CESC发生过程中的生物学作用,尤其关键性的下游靶基因仍有待研究。本研究通过检测非肿瘤和CESC临床样本中E2F1的m RNA和蛋白水平,并进一步探索了稳定敲减E2F1之后CESC细胞增殖、凋亡和迁移等相关表型的变化。研究结果表明E2F1可以促进CESC细胞的增殖。同时,运用生物信息学分析方法筛选并用实验验证了E2F1在CESC中调控的关键性下游靶基因和下游mirNAs（Micro-RNAs）。研究方法:1、通过GEpIA2在线分析平台,展示E2F家族在TCGA（The cancer genome atlas）CESC中和GTEx（The genotype-tissue expression）正常组织中的差异表达。2、通过TCGA在线分析工具UCSC XENA,探讨E2F家族与CESC的预后相关性。3、通过实时荧光定量聚合酶链反应（Reverse transcriptionquantitative polymerase chain reaction,RT-q pCR）检测90例临床样本（非肿瘤组:35例;CESC组:55例）中的E2F1 m RNA表达情况。4、利用蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）和免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）法检测临床样本中的E2F1蛋白水平。5、通过RT-q pCR和Western blot检测Hela和Siha细胞中的E2F1表达。6、应用慢病毒细胞转染技术,构建sh-negative control（NC）Hela、sh-E2F1 Hela、sh-NC Siha和sh-E2F1 Siha四组稳转细胞系。7、通过细胞计数和MTT（Methyl tetrazolium,MTT）比色法检测上述四组细胞中敲减E2F1后细胞的生长变化。8、通过Western blot检测四组细胞中敲减E2F1后Ki-67的蛋白表达。9、通过TUNEL（Terminal d UTp nick-end labeling,TUNEL）细胞凋亡检测法检测这四组细胞中敲减E2F1后细胞凋亡水平的变化。10、通过划痕愈合实验检测这四组细胞中敲减E2F1后细胞迁移能力的变化。11、通过生物信息学分析法,筛选CESC中E2F1可调控的潜在性下游靶基因。12、通过RTq pCR检测上述四组细胞中敲减E2F1后E2F1潜在下游靶基因的表达变化,并验证这些潜在性下游靶基因在临床样本中的差异表达及与E2F1表达的相关性。13、通过生物信息学分析法,筛选CESC中E2F1可调控的潜在性下游靶mirNAs。14、通过RT-q pCR检测潜在性下游靶mirNAs在临床样本中的差异表达及其与E2F1表达的相关性。15、通过RT-q pCR检测上述四组细胞中敲减E2F1后潜在下游靶mirNAs的表达变化。研究结果:1、TCGA和GTEx数据分析显示E2F1、E2F2、E2F3、E2F7和E2F8在CESC组织中较正常组织高表达。2、E2F1高表达与CESC良好预后（包括总生存率）呈正相关。3、与非肿瘤临床样本相比,E2F1在CESC临床样本中高表达。4、敲减E2F1抑制Hela细胞和Siha细胞的增殖。5、敲减E2F1对Hela细胞和Siha细胞的细胞凋亡无明显影响。6、敲减E2F1对Hela细胞和Siha细胞迁移无明显影响。7、生物信息学分析法结果显示:ASF1B、CENpM、CHAF1B、GINS2、MCM3、pCNA、R

关键词：宫颈癌 E2F1 CENpM hsa-mir-16-2-3p hsa-mir-20b-3p

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