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Biomedical and Environmental Sciences 2017年第7期30卷 473-481页

作者： HUANG Wen Si XU Feng Mei ZENG Qing Zhong LIU Xiao Hui GAO Xue Juan LIU Lang Xia Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes Institute of Life and Health Engineering Jinan University Guangzhou 510632 Guangdong China

Objective Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） resistance greatly limits the clinical therapeutic efficacy of TRAIL. Elucidating the molecular mechanism underlying TRAIL resistance will be fundamental to resolving this problem. Methods Nuclear and cytoplasmic protein extraction and immunofluorescence （IF） assay were used to detect changes in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K （hnrnpk） localization in H1299 cells. The evaluation of cell apoptosis in cells transfected with GFP-hnrnpk, GFP-hnrnpk S284/353A, or GFP-hnrnpk S284/353D mutant was performed using cleaved caspase-3 antibody. The gene expression of XIAP was tested by quantitative RT-PCR. Results Previously, we reported that hnrnpk antagonized TRAIL-induced apoptosis through inhibition of PKC-mediated GSK313 phosphorylation. In this study, we further demonstrate that TRAIL treatment induces cytoplasmic accumulation of hnrnpk in H1299 cells. The hnrnpk localized in the cytoplasm has a higher capacity to antagonize TRAIL-induced apoptosis. Both ERK1/2 signaling inhibitor U0126 and ERK-phosphoacceptor-site mutant （GFP-hnrnpk S284/353A） diminish cytoplasmic accumulation of hnrnpk induced by TRAIL. Moreover, we show that XlAP is involved in hnrnpk-mediated TRAIL resistance in H2299 cells. Conclusion Taken together, these results give new insights into the understanding of the molecular mechanism associated with TRAIL resistance in lung adenocarcinoma.

关键词： Apoptosis ERK1/2 hnrnpk TRAIL

环状RNA hsacirc0000231与hnrnpk相互作用对乳腺癌增殖、迁移及凋亡的影响

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陆军军医大学学报 2022年第12期44卷 1207-1220页

作者：胡梦婷陈俊霞重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的研究环状RNA hsa_circ_0000231与hnrnpk相互作用对乳腺癌增殖、迁移及凋亡的影响。方法采用微阵列分析技术对4对乳腺癌组织及其癌旁组织的环状RNA表达谱进行分析。选取重庆医科大学附属第一医院2019年9月至2021年1月收治的乳腺癌... 详细信息

目的研究环状RNA hsa_circ_0000231与hnrnpk相互作用对乳腺癌增殖、迁移及凋亡的影响。方法采用微阵列分析技术对4对乳腺癌组织及其癌旁组织的环状RNA表达谱进行分析。选取重庆医科大学附属第一医院2019年9月至2021年1月收治的乳腺癌患者癌组织标本35例,qRT-PCR验证hsa_circ_0000231的相对表达量,FISH实验检测其在细胞中的定位与表达。转染干扰质粒后,通过划痕、CCK-8、EdU、克隆形成、Hoechst33342、TUNEL、流式细胞仪和Transwell实验检测hsa_circ_0000231在乳腺癌细胞迁移、侵袭、增殖和细胞凋亡中的作用,Western blot检测CCND2、CCND1和CDK4的表达变化;在裸鼠体内研究hsa_circ_0000231对移植瘤生长的影响。RNA pulldown实验检测与hsa_circ_0000231作用的相关蛋白表达,FISH-IF实验观察hsa_circ_0000231与hnrnpk的亚细胞定位,qRT-PCR和Western blot检测c-Myc的表达变化。结果 hsa_circ_0000231在乳腺癌组织(Phnrnpk蛋白与hsa_circ_0000231共定位于细胞核,且与hsa_circ_0000231相互作用能促进c-Myc的表达。结论敲低hsa_circ_0000231能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期,并在体内抑制移植瘤生长,hsa_circ_0000231能够与hnrnpk相互作用增强c-Myc的表达,从而促进乳腺癌的发生和发展。

关键词：乳腺癌环状RNA Hsa_circ_0000231 hnrnpk 细胞增殖细胞凋亡移植瘤

Downregulation of hnrnpk in human cancer cells inhibits lung metastasis

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Animal Models and Experimental Medicine 2019年第4期2卷 291-296页

作者： Mengyuan Li Wenlong Zhang Xingjiu Yang Hongfei Liu Lin Cao Weisha Li Le Wang Guoxin Zhang Ran Gao Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine(National Health and Family Planning Commission) The Institute of Laboratory Animal ScienceChinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical CollegeBeijingP.R.China Beijing Engineering Research Center for Experimental Animal Models of Human Critical Diseases BeijingP.R.China

Background: Lung cancer frequently occurs in the clinic, leading to poor prognosis and high mortality. Markers for early diagnosis of lung cancer are scarce, and further potential therapeutic targets are also urgently needed.Method: We established a new mouse model in which the specific gene hnrnpk(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) was downregulated after administration of doxycycline. The lung metastatic nodules were investigated using bioluminescence imaging, micro-CT, and autopsy quantification.Results: Compared with the short hairpin negative control group, less lung metastatic nodules were formed in the short hairpin RNA group.Conclusion: Downregulation of hnrnpk in cancer cells can inhibit lung metastasis.

关键词： hnrnpk lung metastasis mouse model

慢病毒介导的hnrnpk下调对肝癌细胞HepG2增殖及迁移的影响

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中国比较医学杂志 2022年第4期32卷 54-59,115页

作者：李梦媛张文龙杨星九朱紫薇张国新魏育敏高苒中国医学科学院医学实验动物研究所国家人类疾病动物模型资源库国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心北京100021

目的构建慢病毒介导hnrnpk下调的HepG2细胞稳转株,研究hnrnpk沉默对肝癌细胞增殖与迁移功能的影响。方法以构建的慢病毒感染HepG2细胞并筛选阳性细胞获得稳定表达的细胞株,并检测hnrnpk表达效率。通过CCK-8法与细胞克隆形成实验研究HNR... 详细信息

目的构建慢病毒介导hnrnpk下调的HepG2细胞稳转株,研究hnrnpk沉默对肝癌细胞增殖与迁移功能的影响。方法以构建的慢病毒感染HepG2细胞并筛选阳性细胞获得稳定表达的细胞株,并检测hnrnpk表达效率。通过CCK-8法与细胞克隆形成实验研究hnrnpk下调对细胞增殖的影响。通过划痕实验与Transwell实验研究hnrnpk下调对细胞迁移的影响。结果成功构建了慢病毒介导hnrnpk沉默的HepG2细胞稳转株,hnrnpk沉默显著抑制了HepG2细胞的增殖与迁移能力。结论hnrnpk下调能够在体外抑制HepG2细胞的增殖与迁移。

关键词： hnrnpk HepG2 细胞迁移细胞增殖

SPOP介导癌蛋白hnrnpk的泛素化降解并抑制前列腺癌细胞增殖的机制研究

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SPOP介导癌蛋白HnRNPK的泛素化降解并抑制前列腺癌细胞增殖的机制...

作者：李先缪华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探究核内不均一核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnrnpk)在人类前列腺癌发生发展中的分子功能及作用机制,寻找细胞内调控hnrnpk蛋白稳态的潜在因素,为提升前列腺癌的治疗效果探寻新的干预靶点。方法:RT-qPC... 详细信息

目的:探究核内不均一核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnrnpk)在人类前列腺癌发生发展中的分子功能及作用机制,寻找细胞内调控hnrnpk蛋白稳态的潜在因素,为提升前列腺癌的治疗效果探寻新的干预靶点。方法:RT-qPCR检测人类前列腺癌细胞系中hnrnpk的m RNA表达水平。采用免疫印迹法检测hnrnpk等蛋白的表达水平。流式细胞仪检测细胞周期。MTS细胞增殖实验和集落形成试验用于研究细胞增殖情况。通过免疫沉淀法分析SPOP与hnrnpk的相互作用。采用体内泛素化实验来检测细胞内蛋白hnrnpk的泛素化水平。采用前列腺癌异种移植小鼠模型检测hnrnpk所发挥的体内致癌效应。结果:在本研究中,我们注意到hnrnpk在多种前列腺癌细胞系中表达增高。在前列腺癌细胞系中沉默hnrnpk能够导致癌细胞增殖能力降低和细胞周期阻滞。我们研究进一步表明,Cullin 3/SPOP E3泛素连接酶复合物能够促进hnrnpk在前列腺癌细胞内泛素依赖的蛋白水解,从而调控hnrnpk蛋白的稳定性和致癌功能。此外,前列腺癌相关的SPOP突变体不能与hnrnpk蛋白相互作用从而丧失其对hnrnpk的降解功能。结论:本研究结果揭示了在前列腺癌发生过程中hnrnpk扮演了重要的致癌角色,并发现其蛋白水平受到E3泛素连接酶接头蛋白SPOP的调控。更重要的是,鉴于hnrnpk的关键致癌作用和前列腺癌中SPOP突变的高频发生,我们的研究结果为SPOP突变型前列腺癌患者的抗癌药物开发提供了理论基础。

关键词： hnrnpk SPOP 前列腺癌

PRMT1介导的hnrnpk精氨酸甲基化在结直肠癌中的分子机制探究

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PRMT1介导的hnRNPK精氨酸甲基化在结直肠癌中的分子机制探究

作者：邵付丹内蒙古大学

学位级别：硕士

结直肠癌(CRC)是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,是我国第二大癌症。最新统计数据显示,每年新发肠癌达40.8万人。近年来,尽管新辅助放化疗、免疫治疗等技术已广泛应用于晚期CRC患者治疗,但由于早发性结直肠癌发病率上升,晚期CRC... 详细信息

结直肠癌(CRC)是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,是我国第二大癌症。最新统计数据显示,每年新发肠癌达40.8万人。近年来,尽管新辅助放化疗、免疫治疗等技术已广泛应用于晚期CRC患者治疗,但由于早发性结直肠癌发病率上升,晚期CRC患者预后仍然较差等因素,CRC仍严重危害着人们的健康。因此,探究结直肠癌相关发病分子机制,筛选新的治疗靶点及更有效的靶向治疗药物仍是目前研究的重点。结直肠癌的发生发展受多种因素影响,是一个涉及多基因、多步骤参与的复杂调控过程。因此,需要协同多层面整合分析,构建结直肠癌相关基因表达图谱,以阐明结直肠癌发病分子机制。本研究中,首先从蛋白层面基于蛋白组学测序对结直肠癌相关差异表达蛋白进行筛选鉴定。关注到与转录调控密切相关的hnRNP家族蛋白在结直肠癌组织中均高表达。因此,我们聚焦于hnrnpk基因功能分析,整合转录及蛋白多层面调控机制研究,探究结直肠癌的发病分子机制。深入分析发现,hnrnpk在CRC中表达升高;功能富集分析结果显示,hnrnpk在CRC中的功能与细胞周期、转录调控及癌症发生发展密切相关。随后,细胞实验证明,hnrnpk在结直肠癌细胞中显著高表达;抑制内源hnrnpk表达可显著抑制结直肠癌细胞增殖活力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力,并导致细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。这些实验结果表明,hnrnpk可作为促癌基因发挥功能,参与调控CRC进展。越来越多的证据表明,hnrnpk蛋白翻译后修饰与其在疾病进展中的功能密切相关。为了探究CRC中hnrnpk蛋白翻译后修饰对其功能的影响。我们将目光聚焦于hnrnpk蛋白精氨酸甲基化修饰。我们通过数据库预测分析发现,hnrnpk蛋白KI结构域的RGG基序中存在多个可被双甲基化修饰的精氨酸位点(R256、R258、R268、R296、R299)。而已有文献证明,PRMT1可以调控RGG基序的精氨酸甲基化。随后,我们的Co IP实验也证实,PRMT1确实能够与hnrnpk相互作用。细胞实验表明,在结直肠癌细胞中PRMT1表达也显著升高。且与hnrnpk细胞功能类似,敲低PRMT1亦显著抑制结直肠癌细胞的增殖活力、克隆形成能力、迁移能力与侵袭能力,并且导致细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。因此,PRMT1与hnrnpk均作为促癌基因发挥功能,可能通过PRMT1-hnrnpk轴协同调控结直肠癌细胞生物学功能。为了探究PRMT1是否能够介导hnrnpk蛋白精氨酸甲基化修饰。我们通过IP实验发现,抑制PRMT1表达后,hnrnpk精氨酸甲基化水平降低,即PRMT1介导hnrnpk精氨酸甲基化。随后,我们构建了上述五个精氨酸位点突变为赖氨酸(hnrnpk 5RK)的细胞系,IP检测发现,突变型细胞系中hnrnpk的精氨酸甲基化水平显著下降。细胞实验证实,hnrnpk低精氨酸甲基化抑制了CRC细胞的增殖活力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力,促进了细胞凋亡。综上所述,PRMT1介导的hnrnpk精氨酸甲基化促进了hnrnpk在结直肠癌中的促癌功能。此外,我们也探究了hnrnpk精氨酸甲基化修饰对其核质分布的影响。细胞定位实验显示,hnrnpk精氨酸甲基化水平并不影响其在细胞核内的定位。基于hnrnpk转录调控功能,我们也探究了PRMT1介导hnrnpk精氨酸甲基化影响CRC进展的转录调控分子机制。我们通过数据库分析筛选鉴定了PRMT1-hnrnpk通路下游转录调控靶基因,共鉴定到16个靶基因。对其中5个主要基因(CKS2、PTMA、PAICS、SUV39H2、NPM1)进行了表达水平的检测。结果发现,hnrnpk低精氨酸甲基化抑制了这5个基因的表达水平。且功能富集分析表明,这5个基因主要富集在转录及癌症相关通路。说明PRMT1介导的hnrnpk精氨酸甲基化可能通过调控这些基因的表达,进而影响相关生物学功能或细胞信号通路,促进结直肠癌进展。综上所述,本研究探讨了hnrnpk及其精氨酸甲基化修饰在结直肠癌进展中的功能,阐明了PRMT1-hnrnpk协同调控结直肠癌进展的分子机制。该结果将为破解CRC发病机制提供理论支撑,为结直肠癌治疗提供新靶点,助力于有效缓解结直肠癌这一日益严重的全球公共卫生挑战。

关键词：结直肠癌 hnrnpk 精氨酸甲基化修饰 PRMT1

KUB3与hnrnpk相互作用介导DNA双链断裂损伤修复的研究

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KUB3与hnRNPK相互作用介导DNA双链断裂损伤修复的研究

作者：卢珊华中科技大学

学位级别：硕士

DNA极易受到内源性和外源性因素的攻击,从而造成DNA损伤。为了应对这种威胁,细胞进化出多种DNA损伤修复机制,其中包括DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)损伤修复机制。KUB3是一个从酵母到人高度保守的蛋白,前期研究发现KUB3与脑胶... 详细信息

DNA极易受到内源性和外源性因素的攻击,从而造成DNA损伤。为了应对这种威胁,细胞进化出多种DNA损伤修复机制,其中包括DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)损伤修复机制。KUB3是一个从酵母到人高度保守的蛋白,前期研究发现KUB3与脑胶质瘤细胞的DSB损伤修复能力和抗辐射能力密切相关,但KUB3介导DSB损伤修复的机制尚不清楚。本研究通过免疫共沉淀联合质谱分析,发现KUB3可能与核内不均一性核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleo protein K,hn RNPK)相互作用,并通过免疫共沉淀和GST pull-down实验进一步验证KUB3与hn RNPK直接相互作用。hn RNPK是DSB损伤修复的相关修饰因子,因此本研究进一步探究KUB3与hn RNPK的关系。q RT-PCR和Western blot结果显示,在HEK293细胞中敲低或过表达KUB3,hn RNPK的表达量不变。但在HEK293细胞中敲低hn RNPK,KUB3的表达量上升;过表达hn RNPK,KUB3的表达量下降。同时发现敲低hn RNPK引起p21的表达量下降,敲低KUB3则导致p21的表达量上升。这些结果表明,在HEK293细胞中,KUB3参与hn RNPK-p21信号通路调控,KUB3位于hn RNPK和p21的中间,且hn RNPK对KUB3起抑制作用,KUB3对p21起抑制作用。本研究使用具有较强DNA损伤修复能力的He La细胞进一步检测KUB3在hn RNPK-p21信号通路中的功能。q RT-PCR和Western blot结果显示,在He La细胞中,敲低或过表达KUB3,hn RNPK的表达量不变,敲低hn RNPK,KUB3的表达量上升,p21的表达量下降,而敲低KUB3,p21的表达量上升,过表达KUB3,p21的表达量下降。因此在He La细胞中,KUB3同样参与hn RNPK-p21信号通路调控,且hn RNPK对KUB3起抑制作用,KUB3对p21起抑制作用,这与HEK293细胞中的结果相一致。为了进一步探究KUB3介导DSB损伤修复的机制,本研究采用顺铂诱导He La细胞发生DNA损伤,构建DNA损伤模型。结果发现He La细胞经顺铂处理24 h后,γH2AX、KUB3、hn RNPK、p-p53、p53和p21表达量均上升,表明He La细胞经顺铂处理后发生了DSB损伤,并且hn RNPK-KUB3-p21信号通路被激活。进一步研究发现He La细胞敲低KUB3后γH2AX表达量增加,表明DSB损伤加剧。同时发现经顺铂处理不同时间(24 h和36 h)后,He La细胞中γH2AX的表达量先上升后下降,而hn RNPK、KUB3和p21表达量却持续升高,这表明He La细胞经顺铂处理不同时间后,hn RNPK-KUB3-p21信号通路被激活,并发生了DSB损伤和修复的过程。此外,与顺铂处理组相比,敲低KUB3与顺铂同时处理组发现γH2AX和p21的表达量上升,hn RNPK的表达量不变。这些结果进一步表明KUB3通过hn RNPKp21信号通路介导DSB损伤修复,且沉默KUB3导致DSB损伤修复效率降低。综上所述,本研究首次发现hn RNPK是KUB3的相互作用蛋白,KUB3位于hn RNPK-p21信号通路上,同时发现KUB3通过hn RNPK-p21信号通路介导由顺铂引起的DSB损伤修复。本研究初步探究了KUB3介导DSB损伤修复的机制,加深了对KUB3功能和DNA损伤修复机制的了解,并为通过干预DNA损伤修复效率治疗肿瘤提供了一种新思路。

关键词：信号通路 DNA双链断裂损伤修复 KUB3 hnrnpk p21

hnrnpk与Nef相互作用并有利于细胞表面CD4的表达

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中国生物工程杂志 2015年第4期35卷 17-22页

作者：魏金梅范小琴熊海庭高学娟刘小会刘朗夏广东省高校功能蛋白质研究重点实验室暨南大学生命与健康工程研究院广州510632

目的:前期不同的研究分别证明HIV蛋白Nef下调宿主细胞表面受体CD4的表达,以及Nef与宿主细胞蛋白heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K(hnrnpk)存在相互作用。因此提出了两个值得研究探讨的重要问题:(1)hnrnpk是否参与调节细胞表面... 详细信息

目的:前期不同的研究分别证明HIV蛋白Nef下调宿主细胞表面受体CD4的表达,以及Nef与宿主细胞蛋白heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K(hnrnpk)存在相互作用。因此提出了两个值得研究探讨的重要问题:(1)hnrnpk是否参与调节细胞表面CD4的表达?(2)Nef是否通过hnrnpk调节细胞表面CD4的表达?方法:利用半体外GST-pulldown技术验证Nef与hnrnpk存在相互作用。通过瞬时转染的方式将HIV-1Nef表达在He La-CD4细胞里,同时利用siRNA干扰技术敲低hnrnpk,最后运用流式细胞技术检测细胞表面CD4的表达水平。结果:(1)GST-pulldown结果验证了Nef与hnrnpk存在相互作用;(2)Nef的表达使细胞表面CD4水平下降约75%;(3)不管是否有Nef,hnrnpk的敲低都使细胞表面CD4表达水平明显下降(50%);同样的,Nef下调CD4的作用也不受hnrnpk敲低的影响。结论:(1)hnrnpk与Nef相互作用;(2)hnrnpk有利于细胞表面CD4的表达,其与Nef的下调作用的关系尚不明确,Nef对CD4的下调作用可能涉及有其他因素参与的复杂调控。

关键词：分子生物学 Nef CD4 hnrnpk 流式细胞术

猪hnrnpk蛋白与酪氨酸蛋白激酶c-Src的互作分析

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畜牧兽医学报 2018年第2期49卷 243-252页

作者：梁小娟徐海霞李瑞张朋朋徐永杰信阳师范学院生命科学学院信阳464000 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 信阳师范学院大别山农业生物资源保护与利用研究院信阳464000

旨在探讨猪不均一核糖核蛋白K(hnrnpk)与含SH3结构域的非受体型酪氨酸激酶(c-Src)之间的互作关系。采用PCR和酶切连接的方法,构建pGBKT7-hnrnpk、pGADT7-c-Src、pGADT7-ΔSH3、pGADT7-ΔSH2、pGADT7-ΔPTKc和pGADT7-SH3酵母双杂交载体,用PEG-LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定其自激活活性,并通过酵母双杂交方法从体内验证猪hnrnpk蛋白与c-Src不同缺失体之间的相互作用;采用DNA重组技术构建pET28a-hnrnpk与pGEX-6p1-c-Src、pGEX-6p1-ΔSH3、pGEX-6p1-ΔSH2、pGEX-6p1-ΔPTKc和pGEX-6p1-SH3蛋白表达载体,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化融合蛋白,通过GST pull-down试验从体外验证猪hnrnpk蛋白与c-Src不同缺失体之间的相互作用。结果表明,成功构建了猪hnrnpk与c-Src不同缺失体的酵母双杂交重组质粒,转化酵母细胞发现各质粒均无自激活活性;在酵母中,与阴性对照相比,共转化pGBKT7-hnrnpk与pGADT7-c-Src或pGADT7-ΔPTKc或pGADT7-SH3的酵母菌落在SDTrp-Leu-His-Ade四缺培养基上生长良好,表明在酵母中hnrnpk与c-Src激酶N端的SH3结构域之间存在直接的相互作用;成功构建了猪hnrnpk与c-Src不同缺失体的融合表达质粒,经IPTG诱导表达及纯化获得了可溶性His-hnrnpk、GST-c-Src、GST-ΔSH3、GST-ΔSH2、GST-ΔPTKc和GST-SH3融合蛋白,GST pull-down试验表明,hnrnpk与c-Src N端存在较强的相互作用,与SH2和PTKc结构域相互作用则较弱。本研究揭示了猪hnrnpk蛋白可与c-Src蛋白的N-端的SH3结构域互作,有助于进一步研究它们的调节位点,为深入探讨hnrnpk与c-Src相互调控关系,进而阐明其生物学功能奠定了基础。

关键词：猪 hnrnpk c-Src SH3结构域酵母双杂交 GST-Pull down

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hnrnpk在小鼠精子发生中的功能研究

hnRNPK在小鼠精子发生中的功能研究

作者：韩秋信阳师范学院

学位级别：硕士

精子发生是一个连续而又复杂的高度协调的细胞增殖、分化的动态过程,主要包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形等三个阶段。每个阶段都受到基因表达的精确调控,才能确保精原细胞分化为精母细胞,最终形成单倍体长形... 详细信息

精子发生是一个连续而又复杂的高度协调的细胞增殖、分化的动态过程,主要包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形等三个阶段。每个阶段都受到基因表达的精确调控,才能确保精原细胞分化为精母细胞,最终形成单倍体长形精子。目前,精子发生的生物学机制仍未完全揭示,探讨与精子发生相关的基因、分子及其作用机制,依然是未来生殖生物学研究的热点和重点。不均一性核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnrnpk)是一个多功能蛋白,也是重要的转录调控因子,对动物胚胎发育及细胞的增殖分化起着关键的调控作用。已有研究表明hnrnpk高表达于动物睾丸组织中,在精子发生过程中可能起着重要作用,但缺乏系统的研究。本研究通过构建雄性生殖细胞特异性敲除小鼠模型,研究hnrnpk在小鼠精子发生过程中的作用及分子机制。主要取得了以下研究结果:(1)qRT-PCR和Western blot方法证实hnrnpk在小鼠睾丸组织中高表达;免疫组织荧光结果表明hnrnpk在精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子细胞中具有较高的表达水平。(2)利用Cre-Loxp系统,选取Stra8-Cre小鼠与hnrnpk小鼠杂交,得到hnrnpk/Stra8-Cre的杂合子小鼠,再用杂合子雌性小鼠与雄性hnrnpk小鼠交配得到hnrnpk基因敲除小鼠(hnrnpk/Stra8-Cre,简称KO);Western blot和免疫荧光表明hnrnpk在小鼠睾丸组织生殖细胞中特异性敲除,该模型可用于后续进一步研究。(3)KO小鼠出生率符合孟德尔遗传定律,生长发育正常,外观与野生型相比无显著差异,但睾丸体积变小,从14日龄起睾丸重与体重比值显著小于野生型小鼠(phnrnpk影响了精子发生的正常进行,进而影响小鼠睾丸发育。(4)利用免疫荧光技术结合计数统计分析以确定缺失的细胞类型,结果显示:与野生型相比,KO小鼠中γH2AX阳性细胞数目显著减少,特别是γH2AX点状着色的粗线期或双线期精母细胞(p0.05);Ki67阳性着色细胞数目也显著减少(phnrnpk敲除抑制生殖细胞增殖促进凋亡,进而导致管腔中减数分裂期细胞显著减少,提示hn RNPK敲除可能通过影响精母细胞减数分裂过程进而阻滞精子发生。(5)通过免疫组织荧光检测DNA损伤相关蛋白γH2AX和hnrnpk,顶体标志蛋白PNA和hnrnpk的表达,发现在KO小鼠中能观察到hnrnpk阴性的粗线期精母细胞,但不能观察到hnrnpk阴性的双线期精母细胞和hnrnpk阴性的圆形精子;进一步通过染色体铺展结合免疫组织荧光检测联会复合体蛋白SYCP3和hnrnpk的表达,发现KO小鼠中可以观察到粗线期精母细胞,而双线期精母细胞数量很少。以上结果表明hnrnpk敲除后可能通过影响粗线期精母细胞向双线期精母细胞的转变过程进而导致精子发生减数分裂进程阻滞,无法形成圆形精子。(6)对4周龄KO和WT小鼠睾丸组织进行RNA-Seq分析,通过q RT-PCR进一步验证差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果相符。结果发现,与野生型相比,4W上调基因6227个,下调基因3841个(qhnrnpk与精子发生密切相关。在KO小鼠睾丸的下调基因中,基因表达量较高且下调倍数较大的基因类群主要与精子发育、睾丸特异组蛋白变体以及圆形精子形成相关基因。KEGG富集分析显示上调表达基因富集的通路有PI3K-Akt信号通路和ECM相互作用通路,下调表达基因富集的通路有c AMP信号通路,这暗示hnrnpk可能通过参与这些信号通路从而调控精子发生过程。综上所述,本研究通过Cre-LoxP系统首次成功构建了减数分裂前生殖细胞特异性敲除hnrnpk小鼠,并从细胞、组织和个体水平系统研究了hnrnpk敲除对小鼠精子发生过程的影响。发现hnrnpk敲除会导致减数分裂期细胞增殖减少、凋亡增多,精子发生在稍早于圆形精子阶段发生阻滞,不能形成圆形精子,导致雄鼠不育;KO小鼠曲细精管管腔中可以观察到hnrnpk阴性的

关键词： hnrnpk 精子发生雄性不育条件性敲除小鼠减数分裂