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his-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性

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中国免疫学杂志 2008年第12期24卷 1066-1070页

作者：曾瑞红王卫华房桂珍龚伟梅兴国魏林河北医科大学免疫教研室石家庄050017 河北医科大学生物医学工程中心石家庄050017 军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

目的:观察his-tag是否影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。方法:PCR扩增G1和F/M2基因片段,插入表达载体pET-his和pET-DsbA-his中,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和层析法纯化得his-G1F/M2和DsbA-his-G1F/M2,将后者用凝血酶消化,再经Ni+螯合亲和层析法纯化得G1F/M2,将his-G1F/M2和G1F/M2免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果:两种蛋白在BALB/c小鼠中诱导的RSV特异性抗体和CTL活性无显著差异。结论:his-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。

关键词：呼吸道合胞病毒 his-tag 重组蛋白G1F/M2 免疫原性

his-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质研究及生物感应器的构建

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His-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质研究及生物...

作者：林乐懿北京化工大学

学位级别：硕士

L-脯氨酸脱氢酶是一种生物体中广泛存在的酶,能在有电子接收体存在的情况下氧化L-脯氨酸。从日本温泉附近采集的超嗜热菌Thermococcus profundus,通过基因工程手段在其色素依存性L-脯氨酸脱氢酶基因片段中引入Hig-tag做标记并将该质粒... 详细信息

L-脯氨酸脱氢酶是一种生物体中广泛存在的酶,能在有电子接收体存在的情况下氧化L-脯氨酸。从日本温泉附近采集的超嗜热菌Thermococcus profundus,通过基因工程手段在其色素依存性L-脯氨酸脱氢酶基因片段中引入Hig-tag做标记并将该质粒提取纯化。采用E. coli Rosetta-gami (DE3) Competent Cells菌株进行质粒转换并培养,超声菌体破碎,热处理后使用Ni sepharose分离,得到纯度较高的his-tagL-脯氨酸脱氢酶(Dye-linked L-pro DH)。纯化后的酶液经凝胶电泳得到分离,分离片段为58.6 kDa,40.2 kDa,22.3 kDa,与理论值吻合。证明了his-tag和镍离子具有较强特异性结合,达到了较明显的纯化效果,为今后对该酶的定向固定化应用奠定基础。对该酶的性质在温度,缓冲体系pH值和缓冲溶液种类的选择上作了初步探索,得出最适宜酶活温度为50℃,300 mM的Tris缓冲溶液和pH值为8.0。利用物理吸附的方法将纯化后的his-tagL-脯氨酸脱氢酶固定在多壁碳纳米管(MCNT)修饰的玻碳电极表面。研究发现：在pH 7.5浓度300mM的磷酸缓冲溶液中,加入底物L-脯氨酸后,修饰电极上发生了可逆的氧化还原反应,表明his-tagL-脯氨酸脱氢酶在修饰电极上保持了自身的生物活性,并且多壁碳纳米管起到了良好电子传递体功能。为了验证该酶的his-tag的定向固定化性能,进行了石英晶体微天平(QCM)实验,在引入镍离子的金电极表面,his-tagL-脯氨酸脱氢酶相对于牛血清蛋白,表现出明显的特异性吸附,证明了his-tag的良好定向固定化性能。

关键词：超嗜热菌 his-tag 色素依存性L-脯氨酸脱氢酶镍亲和色谱多壁碳纳米管电催化

带his-tag的乙肝病毒融合抗原在毕赤氏酵母中的表达

同方学位论文库评论

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复旦学报（自然科学版） 2005年第4期44卷 560-565页

作者：胡翔华刘南松吕红袁汉英李育阳复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

乙肝病毒融合抗原SpreS1(简称SS1抗原)较S抗原有更强的免疫原性,可望有更好的临床应用前景.为了便于表达产物的纯化,利用化学合成的寡聚核苷酸链和PCR扩增,在SS1基因的5’端和3’端分别融合了6his-EK和6his的编码序列,将其重组质粒pPIC3... 详细信息

乙肝病毒融合抗原SpreS1(简称SS1抗原)较S抗原有更强的免疫原性,可望有更好的临床应用前景.为了便于表达产物的纯化,利用化学合成的寡聚核苷酸链和PCR扩增,在SS1基因的5’端和3’端分别融合了6his-EK和6his的编码序列,将其重组质粒pPIC3.5k-6his-EK-SS1、pPIC3.5k-SS1-6his转化毕赤氏酵母菌GS115,筛选鉴定得到的重组酵母工程菌进行诱导培养,然后采用镍离子柱(Ni-NTABasin)纯化表达产物,纯化的蛋白样品经ELISA效价测定、SDS-PAGE和WesternBlot分析,结果表明融合抗原基因6his-EK-SS1和SS1-6his在毕赤氏酵母中均能表达,纯化的产物仍有免疫原性,所用的纯化方法简便有效.

关键词：乙肝重组抗原SpreS1 毕赤氏酵母菌镍离子柱融合抗原表达产物毕赤氏酵母乙肝病毒 his-tag SDS-PAGE Western

漆酶N端融合his-tag或S-tag标签促进其在大肠杆菌中可溶性表达

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生物技术通报 2016年第3期32卷 178-183页

作者：岳青霞张丽洁田健伍宁丰姚冬生暨南大学生命科学技术学院广州510632 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 河北农业大学生命科学学院保定071001

来源于地衣芽孢杆菌的漆酶具有催效率高,底物范围广等优点在工农业等领域具有重要的应用前景,但该酶在外源基因表达系统中的表达量低,影响了其在工农业等领域的应用。his-tag和S-tag两种标签由于具有分子量小,且一般不影响外源蛋白性质... 详细信息

来源于地衣芽孢杆菌的漆酶具有催效率高,底物范围广等优点在工农业等领域具有重要的应用前景,但该酶在外源基因表达系统中的表达量低,影响了其在工农业等领域的应用。his-tag和S-tag两种标签由于具有分子量小,且一般不影响外源蛋白性质等特点,在外源蛋白的纯化和检测中具有重要的应用。本研究发现将来源于地衣芽孢杆菌的漆酶Cot A的N端融合histag或S-tag构建于p ET-22b载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)后可以显著提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量,其表达量较N端无融合标签的构建,his-tag可提高漆酶表达量约为37倍,S-tag约可提高20倍,his-tag与S-tag共作用约可提高28倍。

关键词：漆酶 his-tag S-tag 高效表达

SDS-PAGE 法测定his-tag 融合蛋白分子量产生偏差的原因

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植物生理学报（0257-4829) 2000年第1期26卷 64-68页

作者：唐威华张景六王宗阳洪孟民中国科学院上海植物生理研究所上海200032

Ｈｉｓｔａｇ／ＮｉＮＴＡ系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具，现常用于基因编码产物的特性研究中。ＳＤＳＰＡＧＥ是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法，而许多实验室用此方法检测Ｈｉｓｔａｇ融合蛋白时... 详细信息

Ｈｉｓｔａｇ／ＮｉＮＴＡ系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具，现常用于基因编码产物的特性研究中。ＳＤＳＰＡＧＥ是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法，而许多实验室用此方法检测Ｈｉｓｔａｇ融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大，产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题，本实验室在研究一个Ｈｉｓｔａｇ融合蛋白Ｐ７３Ｈｉｓ时，首先用ＳＤＳＰＡＧＥ法测得其分子量确实比理论计算值大，然后对其进行Ｃ末端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析，结果证实其实际分子量与理论值一致。酶切去除包括Ｈｉｓｔａｇ在内的部分肽段使ＳＤＳＰＡＧＥ法测量蛋白分子量的偏差大大降低，证实Ｈｉｓｔａｇ确实是造成偏差的原因之一。推测由于Ｈｉｓｔａｇ中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在ＳＤＳＰＡＧＥ中迁移变慢，而导致偏差。这一现象值得引起有关研究者的注意。

关键词：融合蛋白 SDS-PAGE 分子量 his-tag Ni-NTA

基于his-tag固定模板的抗原决定基分子印迹材料制备

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基于His-tag固定模板的抗原决定基分子印迹材料制备

人Src蛋白N端区段的表达、纯化和体外豆蔻酰化底物活性(英文)

第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会

作者：李森武杨开广张丽华张玉奎大连化学物理研究所

近年来,抗原决定基印迹材料作为一种可对蛋白质进行特异性识别的人工抗体材料越来越受到研究者的关注。本文我们利用his-tag作为锚定位点用于固载抗原决定基,发展了一种新的抗原决定基表面定向印迹材料制备方法。我们利用his-tag可高效... 详细信息

近年来,抗原决定基印迹材料作为一种可对蛋白质进行特异性识别的人工抗体材料越来越受到研究者的关注。本文我们利用his-tag作为锚定位点用于固载抗原决定基,发展了一种新的抗原决定基表面定向印迹材料制备方法。我们利用his-tag可高效固载于Ni,并可被EDTA洗脱的优势,提高了抗原决定基的固载及去除效率;利用多巴胺氧化自聚合的优势,通过调节多巴胺用量对印迹层

关键词： his-tag 分子印迹抗原决定基多巴胺

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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生物化学与生物物理学报 2003年第1期35卷 13-17页

作者：马涵慧杨力李伯良中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

利用RT PCR技术 ,从来源于人结肠癌Caco 2细胞总RNA中 ,扩增得到编码人Src蛋白N端 147氨基酸的DNA序列片段。进而构建T7启动子控制下的C端his tag融合的表达质粒pMF SrcHT ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3)。通过SDS PAGE等分析结果显示 ,在 3... 详细信息

利用RT PCR技术 ,从来源于人结肠癌Caco 2细胞总RNA中 ,扩增得到编码人Src蛋白N端 147氨基酸的DNA序列片段。进而构建T7启动子控制下的C端his tag融合的表达质粒pMF SrcHT ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3)。通过SDS PAGE等分析结果显示 ,在 37°C培养条件下经IPTG诱导 ,C端his tag融合的人Src蛋白N端区段 (命名为SrcHT ,2 1kD)得到高效表达 ,并且主要以可溶性形式存在。进一步利用Ni IDA亲和层析分离 ,从表达菌裂解上清液中一步纯化获得重组蛋白SrcHT ,SDS PAGE分析纯度达 95 %以上。在此基础上 ,以 [3H]豆蔻酰 CoA为同位素标记底物进行SrcHT的体外NMT豆蔻酰化反应测定。SDS PAGE分离和放射自显影分析结果表明 ,SrcHT蛋白可被NMT有效豆蔻酰化而具有NMT的底物活性。这些为深入详细研究Src蛋白豆蔻酰化作用和构建以Src蛋白豆蔻酰化为靶标的分子筛药体系等打下了重要基础。

关键词： Src蛋白 his-tag 融合表达豆蔻酰化

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

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中国环境科学 2012年第10期32卷 1845-1852页

作者：侯晟琦王丽华赖欣陈惠吴琦韩学易四川农业大学生命科学与理学院四川省生物化学与分子生物学重点实验室四川雅安625014

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的... 详细信息

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.:EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经his-tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0.

关键词：角蛋白酶枯草芽孢杆菌B-3 基因克隆 kerC基因原核表达 his-tag

人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

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中国医学科学院学报 2006年第2期28卷 154-158页

作者：苏林刘长征邓艳春杨克恭梁植权陈松森中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Ki... 详细信息

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化*** BL21（DE3）诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.his-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3^DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.

关键词：人干细胞因子受体免疫球蛋白样结构域 his-tag pull-down 酶联免疫结合实验