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重组人高密度脂蛋白B族Ⅰ型清道夫受体基因腺相关病毒血清型2/1杂合载体在hepg2肝细胞的表达

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第6期30卷 696-701页

作者：张玉玲伍卫周淑娴雷娟中山大学附属第二医院心血管内科广东广州510120 中山大学附属第五医院心血管内科广东珠海519000

【目的】构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体,观察其在hepg2肝细胞的表达。【方法】以***6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA,将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa... 详细信息

【目的】构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体,观察其在hepg2肝细胞的表达。【方法】以***6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA,将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa载体中,经酶切及测序鉴定后,脂质体介导转染BHK21细胞,经G418筛选得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株,用携带rep2-cap1基因的辅助病毒(rHsv/r2cl)感染该细胞株。通过细胞孵育、裂解和病毒纯化,得到杂合载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒。免疫荧光显微镜检测绿色荧光表达,计算转染效率,Western Blot检测转染后SR-BI蛋白的表达。【结果】酶切鉴定表明pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP重组成功,基因测序显示装入pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa质粒中的SR-BI基因正确;成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒载体。转染hepg2肝细胞后免疫荧光显微镜检测最佳MOI值为1×105时,以此值转染hepg2肝细胞荧光高效表达;Western Blot检测未转染组及rAAV2/1-IRES-EGFP组hepg2肝细胞均有SR-BI蛋白表达,rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP组SR-BI蛋白表达水平较rAAV2/1-IRES-EGFP组及未转染组显著增加。【结论】成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体系统,转染后SR-BI蛋白在hepg2肝细胞高效表达,为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础。

关键词：高密度脂蛋白 B族I型清道夫受体腺相关病毒 hepg2肝细胞

色素上皮衍生因子对人hepg2肝细胞脂代谢的影响

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重庆医科大学学报 2012年第6期37卷 477-480页

作者：钟立罗梅夏伟杨淑敏李启富重庆医科大学附属第一医院体检中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院内分泌科重庆400016

目的:探讨色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)对人hepg2肝细胞脂代谢的影响。方法:分别用重组人PEDF细胞因子和PEDF抗体干预hepg2肝细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测脂质合成和分解的关键酶mRNA... 详细信息

目的:探讨色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)对人hepg2肝细胞脂代谢的影响。方法:分别用重组人PEDF细胞因子和PEDF抗体干预hepg2肝细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测脂质合成和分解的关键酶mRNA及蛋白水平的变化;裂解细胞后用酶法测定细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。结果:(1)PEDF干预人hepg2肝细胞后,固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element-binding protein1,SREBP1)、脂肪酸合成酶(Fatty acid syn-thase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl coenzyme A carboxylase1,ACC1)、羟甲基戊二酰辅酶还原酶(HMG-coA reductases,HMGR)mRNA的表达较正常对照分别降低39%、38%、61%、32%(P2%、56%、67%、42%(P2)在蛋白水平,PEDF干预后FAS、ACC1、HMGR表达较正常组分别减少58%、54%、43%,而ATGL的表达增加20%(P细胞内TG明显减少([410.40±13.43)mg/g vs.(234.70±35.70)mg/g,P细胞内TG含量有上升趋势,但无统计学差异([410.40±13.43)mg/g vs.(440.32±25.67)mg/g,P=0.67]。结论:PEDF在hepg2肝细胞中可抑制脂肪酸的合成,并促进脂肪分解,从而降低细胞内TG的含量。

关键词： hepg2肝细胞色素上皮衍生因子脂代谢

橄榄苦苷对胰岛素抵抗hepg2肝细胞胰岛素信号传导的影响

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中国实验方剂学杂志 2018年第20期24卷 164-168页

作者：杨双徐继璞遂宁市中心医院

目的：观察橄榄苦苷（oleuropein,OL）对胰岛素抵抗hepg2肝细胞的胰岛素信号传导的影响。方法：常规复苏细胞,于10%FBS＋1%青-链霉素的DMEM（1 g·L^（-1）葡萄糖）培养基中,37℃5%CO_2细胞培养箱中培养,常规细胞培养传至第3代待用;利用... 详细信息

目的：观察橄榄苦苷（oleuropein,OL）对胰岛素抵抗hepg2肝细胞的胰岛素信号传导的影响。方法：常规复苏细胞,于10%FBS＋1%青-链霉素的DMEM（1 g·L^（-1）葡萄糖）培养基中,37℃5%CO_2细胞培养箱中培养,常规细胞培养传至第3代待用;利用1×10^（-6）mol·L^（-1）胰岛素溶液刺激hepg2肝细胞36 h后建立肝细胞胰岛素抵抗模型,分为模型组,OL组（50μmol·L^（-1））,另设正常hepg2肝细胞为正常组,每组设6个复孔;对数生长期细胞,饥饿培养24 h后,诱导建立胰岛素抵抗模型,进行药物干预36 h后,以细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测OL对细胞活性的影响;OL对胰岛素抵抗hepg2肝细胞干预后,实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测肝细胞胰岛素受体（InsR）,胰岛素受体底物-1（IRS-1）,葡萄糖转运蛋白-2（GLUT-2）mRNA和蛋白表达水平。结果：与正常组比较,模型组胰岛素抵抗的hepg2肝细胞活性明显降低（P〈0.05）,胰岛素信号分子InsR,IRS-1,GLUT-2 mRNA和蛋白表达明显降低（P〈0.05,P〈0.01）。与模型组比较,OL干预后胰岛素抵抗的hepg2肝细胞活性显著升高（P〈0.01）;胰岛素信号分子InsR,IRS-1,GLUT-2 mRNA和蛋白表达明显升高（P〈0.05,P〈0.01）。结论：OL能够增加胰岛素抵抗肝细胞活性,上调肝细胞胰岛素信号通路中InsR,IRS-1,GLUT-2 mRNA和蛋白的表达,这可能是其改善胰岛素抵抗的机制之一。

关键词：橄榄苦苷 2型糖尿病胰岛素抵抗 hepg2肝细胞胰岛素受体胰岛素受体底物-1 葡萄糖转运蛋白-2

TNF-α促进hepg2肝细胞脂质积聚及其机制初探

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TNF-α促进HepG2肝细胞脂质积聚及其机制初探

作者：陈书梅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的探讨肿瘤坏死因子-α是否能够促进hepg2肝细胞脂质积聚，并对其机制进行初步探讨。方法将hepg2肝细胞分为空白对照组、单纯TNF-α组（TNF-α2ng/mL或20ng/mL）、软脂酸组（PA0.08mM或0.2mM）及联合组（TNF-α2ng/mL联合PA0.08mM、T... 详细信息

目的探讨肿瘤坏死因子-α是否能够促进hepg2肝细胞脂质积聚，并对其机制进行初步探讨。方法将hepg2肝细胞分为空白对照组、单纯TNF-α组（TNF-α2ng/mL或20ng/mL）、软脂酸组（PA0.08mM或0.2mM）及联合组（TNF-α2ng/mL联合PA0.08mM、TNF-α2ng/mL联合PA0.2mM、TNF-α20ng/mL联合PA0.08mM或TNF-α20ng/mL联合PA0.2mM），处理24h，应用化学酶促-比色法定量检测细胞内TG含量。进一步选取TNF-α20ng/mL和软脂酸0.08mM，通过油红O染色观察hepg2细胞内脂质积聚情况;荧光定量PCR检测hepg2细胞SREBP-1、FAS、ACCα的mRNA表达水平;Western blot检测mTOR、S6K磷酸化水平以及SREBP-1、FAS、ACCα的蛋白表达水平。结果①单纯TNF-α刺激（2ng/ml、20ng/ml）增加hepg2细胞内脂质积聚（P＜0.05）;TNF-α与软脂酸联合处理显著增加胞内TG含量（P＜0.05）;0.2mM软脂酸处理也使胞内TG含量轻度增加（P＜0.05），而0.08mM软脂酸对肝细胞内的TG水平没有影响。②油红O染色进一步显示，TNF-α促进肝细胞内脂质积聚。③定量PCR和Western blot结果显示，单纯TNF-α组与空白对照组相比，hepg2细胞SREBP-1、FAS、ACCα的mRNA和蛋白表达均增加（P＜0.05）;联合组与软脂酸组相比，肝细胞内SREBP-1、FAS、ACCα的mRNA和蛋白表达水平明显上调（P＜0.05）。④W estern blot显示，单纯TNF-α组与空白对照组相比，hepg2细胞mTOR、S6K磷酸化水平升高（P＜0.05）;联合组与软脂酸组相比，mTOR、S6K磷酸化水平明显上调（P＜0.05）。结论TNF-α促进hepg2肝细胞内脂质积聚，上调mTOR、S6K磷酸化水平以及SREBP-1、FAS、ACCα的表达。

关键词：肿瘤坏死因子-α 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白固醇调节元件结合蛋白-1 hepg2肝细胞脂质积聚

阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起hepg2肝细胞的基因表达变化

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癌变．畸变．突变 2018年第4期30卷 258-262页

作者：由淑萍任立松马龙贺笋陈泽良王嵘刘涛新疆医科大学公共卫生学院新疆医科大学护理学院新疆天康畜牧生物技术股份有限公司中国解放军69337部队

目的:通过高通量测序法分析阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起Hep G2肝细胞的基因表达变化,并探讨阪崎肠杆菌致病作用6的分子机制。方法:采用CAYE培养基培养阪崎肠杆菌,硫酸铵沉淀法及膜透析法分离纯化上清蛋白;分别在1×10~6/mL的hepg2肝细... 详细信息

目的:通过高通量测序法分析阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起Hep G2肝细胞的基因表达变化,并探讨阪崎肠杆菌致病作用6的分子机制。方法:采用CAYE培养基培养阪崎肠杆菌,硫酸铵沉淀法及膜透析法分离纯化上清蛋白;分别在1×10~6/mL的hepg2肝细胞培养液中加入终浓度为1.6μg/mL的上清蛋白稀释液及蒸馏水作为实验组和对照组,提取细菌总RNA;构建文库并运用illumina测序平台测序,分析两组间的基因表达差异,采用Gene Ontology(GO)富集分析和Pathway分析了解差异表达基因的功能;荧光定量PCR(qPCR)验证RPS18、RFC4基因差异表达结果。结果:高通量测序结果显示,与对照组相比,实验组hepg2细胞存在5 120个差异表达基因,其中上调2 155个,下调2 965个;GO富集分析显示差异基因主要参与细胞核分裂、有丝分裂、复制等多个生物学过程,Pathway分析显示差异基因主要与DNA复制、蛋白转运、精氨酸和脯氨酸代谢等有关;qPCR验证结果与高通量测序结果一致。结论:阪崎肠杆菌培养上清蛋白能够引起Hep G2肝细胞RPS18、RFC4等基因的表达变化,并可能与核糖体变化和/或DNA复制与修复有关。

关键词：阪崎肠杆菌培养上清 hepg2肝细胞高通量测序

阪崎肠杆菌培养蛋白对乳鼠肝组织及hepg2肝细胞损伤的实验研究

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新疆医科大学学报 2017年第6期40卷 776-778页

作者：由淑萍任立松林环马龙刘涛新疆医科大学公卫学院乌鲁木齐830011 解放军第273医院新疆库尔勒841000

目的分析阪崎肠杆菌培养产物中粗提蛋白质对乳鼠肝组织的损伤作用,探索阪崎肠杆菌新的致病因子。方法采用酪蛋白氨基酸酵母浸膏培养液(CAYE)培养基培养阪崎肠杆菌,饱合硫酸铵沉淀法粗提培养上清;纯化后的上清蛋白质以0.1μg/100μL浓度... 详细信息

目的分析阪崎肠杆菌培养产物中粗提蛋白质对乳鼠肝组织的损伤作用,探索阪崎肠杆菌新的致病因子。方法采用酪蛋白氨基酸酵母浸膏培养液(CAYE)培养基培养阪崎肠杆菌,饱合硫酸铵沉淀法粗提培养上清;纯化后的上清蛋白质以0.1μg/100μL浓度给予乳鼠灌胃,无菌取肝组织,制作病理切片并染色,镜下分析肝组织病理变化特征;以相同浓度的粗提蛋白质体外侵袭hepg2肝细胞,观察细胞生长变化情况。结果阪崎肠杆菌经隔夜培养,从其培养上清中纯化得到分子量为69kDa蛋白质,以0.1μg/100μL浓度对乳鼠灌胃,病理切片分析表明乳鼠肝组织呈现点状坏死特征;侵袭的hepg2肝细胞形态发生变化,并伴有大量细胞死亡。结论从阪崎肠杆菌培养上清中分离纯化的蛋白质,在体内和体外条件下均可对肝细胞产生损伤,推测该蛋白质具生物活性,在一定条件下能够对机体产生损伤,可能在阪崎肠杆菌致病过程中起到重要作用。

关键词：阪崎肠杆菌培养上清乳鼠 hepg2肝细胞

大黄素通过激活PPARγ促进hepg2细胞葡萄糖摄取

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中华内分泌代谢杂志 2007年第3期23卷 264-268页

作者：杨丽娟于海燕母义明汪保安窦京涛陆菊明潘长玉解放军总医院内分泌科北京100853

目的构建PPARγ和PPARγ应答元件（PPRE）荧光素酶系统，并确定大黄单体成分大黄素是否能够通过激活PPARγ促进hepg2肝细胞葡萄糖摄取。方法（1）构建PPARγ和PPRE荧光素酶系统并对20余种中药成分进行筛选；（2）将能够激活PPARγ和P... 详细信息

目的构建PPARγ和PPARγ应答元件（PPRE）荧光素酶系统，并确定大黄单体成分大黄素是否能够通过激活PPARγ促进hepg2肝细胞葡萄糖摄取。方法（1）构建PPARγ和PPRE荧光素酶系统并对20余种中药成分进行筛选；（2）将能够激活PPARγ和PPRE系统的大黄素与hepg2肝细胞进行培养，分别用RT-PCR／Southern杂交测定PPARγmRNA的表达；（3）用Western印迹法测定大黄素处理后的hepg2细胞的PPARγ和葡萄糖转运蛋白2（Glut2）的表达水平；（4）测定大黄素作用后的hepg2细胞对2-脱氧-[^3H]-D-葡萄糖摄取率。结果（1）在筛查的中药成分中，大黄素作用24h后，呈剂量（0．04～180μmol／L）依赖性地增强COS-7细胞PPRE荧光素酶活性，其中90μmol／L浓度时达到最高值，为对照组的4倍（P〈0．01），而10μmol／L浓度的吡格列酮作用强度为对照组的6倍（P〈0．01）；（2）大黄素在90μmol／L浓度时刺激hepg2细胞PPARγmRNA表达水平增加2．7倍（P〈0．01）；（3）大黄素的作用呈剂量和时间依赖性地刺激hepg2细胞PPARγ和Glut2蛋白的表达水平。其中，PPARγ蛋白水平在90μmol／L和作用16h刺激作用最强，约为对照组的3．1—3．8倍（P〈0．01）；Glut2蛋白水平在90μmol／L和作用16h刺激作用最强，约为对照组的2．5—4．3倍（P〈0．01）；（4）hepg2细胞的葡萄糖摄取率在90μmol／L浓度的大黄素作用24h后，约为对照组的5倍（P〈0．01）。结论研究结果显示大黄素刺激hepg2肝细胞PPARγ和Glut2蛋白表达，并促进葡萄糖的摄取。

关键词：大黄素 PPARγ hepg2肝细胞葡萄糖摄取率葡萄糖转运蛋白2

糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞培养上清液诱发胰岛素抵抗的研究

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中国临床药理学杂志 2024年第14期40卷 2033-2037页

作者：李包娟周克春阿布都拉·米热合买提祖丽胡马·热合曼叶雨萌张之新疆医科大学药学院新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830000 新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830000

目的探究糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞及其旁分泌作用在诱发胰岛素抵抗(IR)中扮演的角色。方法建立小鼠糖尿病模型,提取并培养骨髓间充质干细胞(BMSC),收集培养上清液(M-BMSC-CS)。(1)细胞实验:将hepg2肝细胞分为正常低糖培养组[... 详细信息

目的探究糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞及其旁分泌作用在诱发胰岛素抵抗(IR)中扮演的角色。方法建立小鼠糖尿病模型,提取并培养骨髓间充质干细胞(BMSC),收集培养上清液(M-BMSC-CS)。(1)细胞实验:将hepg2肝细胞分为正常低糖培养组[用低糖DMEM(5.55 mmol·L^(-1))进行培养]、M-BMSC-CS实验组(M-BMSC-CS 75μL)、高糖高脂对照组(给予25 mmol·L^(-1)高糖DMEM+0.25 mmol·L^(-1)棕榈酸)。(2)动物实验:小鼠分为正常小鼠组(腹腔注射等体积0.9%NaCl)和M-BMSC-CS-m组(M-BMSC-CS通过腹腔注射给予正常小鼠,注射剂量0.2 mL/10 g)。用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖摄取量,用免疫荧光法检测Glut2蛋白荧光强度,用蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路蛋白表达;检测口服葡萄糖耐量(OGTT)和胰岛素耐量(ITT)。结果正常低糖培养组、M-BMSC-CS实验组和高糖高脂对照组的葡萄糖摄取量分别为(2.96±0.05)、(1.64±0.28)和(1.42±0.32)mmol·L^(-1),葡萄糖转运蛋白2(Glut2)荧光表达分别为53.21±2.70、30.95±3.39和34.96±7.60,磷酸化胰岛素受体底物1-ser307(p-IRS-1ser307)表达蛋白相对水平分别为0.46±0.21、1.09±0.24和0.91±0.16,磷酸化蛋白激酶(p-AKT)蛋白相对表达水平分别为0.94±0.05、0.59±0.06和0.53±0.05,Glut2蛋白表达水平分别为1.08±0.14、0.58±0.14和0.62±0.09;M-BMSC-CS实验组的上述指标与正常低糖培养组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P23±0.57)和(9.30±1.14)mmol·L^(-1),p-AKT蛋白相对表达水平分别为1.27±0.21和0.51±0.19,Glut2蛋白相对表达水平分别为1.17±0.17和0.79±0.09;M-BMSC-CS-m组的上述各指标与正常小鼠组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均Phepg2肝细胞胰岛素抵抗,在体内诱发正常小鼠胰岛素抵抗。

关键词：糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞培养上清液胰岛素抵抗 hepg2肝细胞正常小鼠

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桑叶多酚的降糖作用机制研究

蚕业科学 2024年第3期50卷 242-251页

作者：占鹏飞陈田飞赵辉董馨恬冯佳怡柳秦桥钟石孙雨晴湖州市农业科学研究院浙江湖州313000 淳安县农业农村发展服务中心杭州311700 中国计量大学生命科学学院杭州310018 湖州柳荫生物科技有限公司浙江湖州313009 浙江省农业科学院杭州310021

桑叶自古以来就被用于治疗消渴症(糖尿病),现代医学研究也证明桑叶具有降糖功效。提取纯化获得桑叶多酚,通过蔗糖酶抑制试验、自由基清除试验、高糖诱导hepg2肝细胞胰岛素抵抗试验等多种手段,研究桑叶多酚降糖作用的机制。结果显示,桑... 详细信息

桑叶自古以来就被用于治疗消渴症(糖尿病),现代医学研究也证明桑叶具有降糖功效。提取纯化获得桑叶多酚,通过蔗糖酶抑制试验、自由基清除试验、高糖诱导hepg2肝细胞胰岛素抵抗试验等多种手段,研究桑叶多酚降糖作用的机制。结果显示,桑叶多酚体外抑制蔗糖酶活性的半抑制浓度IC50为0.58 mg/mL,对DPPH自由基、羟自由基、过氧化氢的IC50分别为0.21、6.07、2.44 mg/mL。细胞试验显示,桑叶多酚能够增加高糖诱导的hepg2细胞对葡萄糖的消耗,促进葡萄糖的吸收,降低细胞内活性氧含量,提高了胰岛素信号通路中IR和IRS1的基因表达,在蛋白质水平提高了AKT蛋白的磷酸化,并抑制了糖异生蛋白PGC-1α的基因表达。另外,桑叶多酚还显著提高了脂代谢相关基因C/EBPα、PPARα和Visfatin的表达。以上结果提示,桑叶多酚能够抑制α-葡萄糖苷酶活性,清除自由基,激活肝细胞AKT信号通路,抑制葡萄糖异生,调控脂代谢,从而促进葡萄糖吸收代谢发挥降糖作用。研究结果将为桑叶多酚的功能研究提供基础数据,为桑叶活性物质的开发利用提供参考依据。

关键词：桑叶多酚降糖胰岛素抵抗 hepg2肝细胞