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杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在hepg2中的表达

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第一军医大学学报 2001年第9期21卷 648-649页

作者：郭亚兵戴琳冯筱榕杨洁周福元第一军医大学南方医院感染内科广东广州510515

目的重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列，并插入AcMNPV中，用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。... 详细信息

目的重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列，并插入AcMNPV中，用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株hepg2或hepg2.2.15细胞，测定CAT表达相对活性。结果由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在hepg2或hepg2.2.15细胞均可表达CAT，而NFκB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在hepg2细胞中CAT表达低，而在有HBV表达的hepg2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因，而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。

关键词：杆状病毒载体 hepg2细胞系乙型肝炎病毒肝癌氯霉素乙酰转移酶基因表达

齐墩果酸和绿原酸对hepg2细胞及P450酶的影响

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中成药 2013年第12期35卷 2576-2580页

作者：汤浩刘晓莉王锐高庆剑陆铖孙志博甘肃省人民医院药剂科甘肃兰州730000 宁夏医科大学药学院药理系宁夏银川750000 兰州大学基础医学院遗传所甘肃兰州730000

目的观察齐墩果酸和绿原酸对hepg2细胞增殖、周期变化及CYP相关基因表达的影响。方法以利福平为对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、流式细胞术、实时定量PCR技术检测,测定不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸的作用。结果齐墩果酸、绿原酸... 详细信息

目的观察齐墩果酸和绿原酸对hepg2细胞增殖、周期变化及CYP相关基因表达的影响。方法以利福平为对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、流式细胞术、实时定量PCR技术检测,测定不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸的作用。结果齐墩果酸、绿原酸对hepg2细胞增殖有明显抑制作用,阻滞hepg2细胞停留于S期。齐墩果酸和利福平均能诱导CYP1A1和CYP3A4表达。绿原酸抑制CYP1A1和CYP3A4表达。结论齐墩果酸、绿原酸均能影响细胞周期来抑制hepg2细胞生长,并显示不同质量浓度对CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表达影响不一致。

关键词：齐墩果酸绿原酸 hepg2细胞系细胞增殖细胞周期细胞色素P450酶

过氧化氢诱导同步化hepg2细胞DNA损伤和凋亡的敏感时相研究

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第四军医大学学报 2004年第8期25卷 744-748页

作者：高志清海春旭梁欣曹云新陈宏莉秦绪军赵康涛第四军医大学预防医学系毒理学教研室陕西西安710033

目的 :探讨过氧化氢 (H2 O2 )诱导hepg2细胞的DNA损伤和凋亡效应在细胞周期不同时相的敏感性 .方法 :利用胸腺嘧啶核苷 (TdR)阻断肝癌hepg2细胞于G1期末后 ,去除胸苷 ,培养不同时间 ,分别得到同步化的G1期、S期和G2 /M期细胞 ,1 5 0 μm... 详细信息

目的 :探讨过氧化氢 (H2 O2 )诱导hepg2细胞的DNA损伤和凋亡效应在细胞周期不同时相的敏感性 .方法 :利用胸腺嘧啶核苷 (TdR)阻断肝癌hepg2细胞于G1期末后 ,去除胸苷 ,培养不同时间 ,分别得到同步化的G1期、S期和G2 /M期细胞 ,1 5 0 μmol/L的H2 O2 处理 1 2h ,采用单细胞凝胶电泳技术 (SCGE)测定细胞的DNA损伤 ;将各期细胞用2 0 0 μmol/L的H2 O2 处理 ,采用流式细胞术测定细胞凋亡 .同时实验设立未同步化和正常对照组 .结果 :①分别获得88.6 %的G1期细胞、78.1 %的S期细胞、6 6 .8%的G2 /M期细胞 .②SCGE结果显示 ,同步化于S期和G2 /M期细胞的DNA尾长明显增长 ,尾部DNA百分比含量和尾矩明显增加 ,其中S期细胞效应最为显著 .③凋亡检测结果显示 ,同步化各组细胞的凋亡率明显高于未同步化组 ,以S期最为显著 .结论 :H2 O2 诱导hepg2细胞DNA损伤和细胞凋亡在细胞周期的不同时相效应敏感性不同。

关键词： hepg2细胞系过氧化氢脱噬作用细胞周期

锌、铁饱和乳铁蛋白体外抗HBsAg分泌的研究

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食品科技 2007年第8期32卷 269-272页

作者：李松涛周海波黄桂荣刘宁乳品科学教育部重点实验室东北农业大学哈尔滨150030 哈尔滨医科大学流行病学教研室哈尔滨150081

目的:探讨锌饱和乳铁蛋白(Zn2+-BLF)、铁饱和乳铁蛋白(Fe2+-BLF)体外抑制乙型肝炎表面抗原分泌作用,为锌、铁乳铁蛋白应用于临床治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染提供理论和试验依据。方法:以天然HBV感染hepg2细胞为模型,通过应用ELISA法测定... 详细信息

目的:探讨锌饱和乳铁蛋白(Zn2+-BLF)、铁饱和乳铁蛋白(Fe2+-BLF)体外抑制乙型肝炎表面抗原分泌作用,为锌、铁乳铁蛋白应用于临床治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染提供理论和试验依据。方法:以天然HBV感染hepg2细胞为模型,通过应用ELISA法测定细胞上清中的HBsAg水平来检测Zn2+-BLF、Fe2+-BLF的抗HBsAg分泌效果,并用MTT法对Zn2+-BLF、Fe2+-BLF对hepg2细胞的毒性进行研究。结果:Zn2+-BLF、Fe2+-BLF对细胞的最大无毒剂量(TD0)分别为1.5g/L、3.0g/L;先用HBV对hepg2细胞进行感染,再分别加入Zn2+-BLF、Fe2+-BLF,各浓度组Zn2+-BLF均对HBsAg分泌有一定抑制作用,Zn2+-BLF浓度1.0g/L时对HBsAg的抑制率达60.49%;浓度为1.0g/L、0.5g/L的Fe2+-BLF能显著抑制HBsAg的分泌,但0.1g/L的Fe2+-BLF不能显著抑制HBsAg的分泌。结论:当hepg2细胞感染HBV后,Zn2+-BLF、Fe2+-BLF可以显著抑制HBsAg的分泌,Zn2+-BLF对HBsAg的抑制作用强于Fe2+-BLF,但其作用机理有待深入研究。

关键词：牛源乳铁蛋白金属离子结合体外乙型肝炎表面抗原 hepg2细胞系

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缺铁乳铁蛋白体外抗HBsAg分泌的研究

中国乳品工业 2008年第7期36卷 19-21,28页

作者：诸晓强周海波李松涛黄桂荣刘宁东北农业大学国家乳业工程技术研究中心哈尔滨150030 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室食品学院哈尔滨150030 哈尔滨医科大学哈尔滨150081

研究缺铁乳铁蛋白体外抑制HBsAg作用,为乳铁蛋白应用于临床治疗乙肝病毒感染提供理论和实验依据。以天然HBV感染hepg2细胞为模型,通过应用ELISA法测定细胞上清中的HBsAg水平来检测缺铁乳铁蛋白抗HBsAg分泌效果,并用MTT法进行缺铁乳铁蛋... 详细信息

研究缺铁乳铁蛋白体外抑制HBsAg作用,为乳铁蛋白应用于临床治疗乙肝病毒感染提供理论和实验依据。以天然HBV感染hepg2细胞为模型,通过应用ELISA法测定细胞上清中的HBsAg水平来检测缺铁乳铁蛋白抗HBsAg分泌效果,并用MTT法进行缺铁乳铁蛋白对hepg2细胞毒性研究。结果表明,缺铁乳铁蛋白对细胞的半数中毒剂量(TD50)为8.312 g/L,最大无毒剂量(TD0)为1.5 g/L;用乙肝病毒对hepg2细胞进行感染,分别加入不同浓度的缺铁乳铁蛋白,24,36,48 h测定HBsAg水平,各实验组蛋白对HBsAg分泌几乎没有抑制作用。当hepg2细胞感染乙肝病毒后,缺铁乳铁蛋白不能抑制HBsAg分泌,乳铁蛋白抗HBsAg分泌与其铁饱和度有关,但其机理有待进一步深入研究。

关键词：缺铁乳铁蛋白体外乙型肝炎表面抗原 hepg2细胞系 ELISA

马兜铃酸对hepg2细胞的遗传毒性及硝化DNA损伤机制的研究

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马兜铃酸对HepG2细胞的遗传毒性及硝化DNA损伤机制的研究

作者：吴可亚大连医科大学

学位级别：硕士

前言:马兜铃酸(aristolochic acid, AA)为马兜铃属植物的主要成分,是植物界发现的第一个含硝基的有机物。马兜铃属(Aristolochia)植物广泛分布于热带和亚热带地区,全世界有200多种,我国约有40种以上。该属植物药用价值自古以来就为人所... 详细信息

前言:马兜铃酸(aristolochic acid, AA)为马兜铃属植物的主要成分,是植物界发现的第一个含硝基的有机物。马兜铃属(Aristolochia)植物广泛分布于热带和亚热带地区,全世界有200多种,我国约有40种以上。该属植物药用价值自古以来就为人所知,被广泛用于治疗各种感染症、皮肤病、肿瘤、水肿,咳嗽和关节痛等。但自1993年比利时的学者Vanherweghen等首次报道含有AA的中草药引起进行性间质性肾纤维化最终导致肾衰以后,其他国家也相继发现含AA的中草药对动物和人具有致癌性。一时间世界各国对含有或怀疑含有AA的中草药引起了广泛的关注。20世纪80年代初,体外实验和动物实验结果表明,AA具有较强的致突变和致癌作用。根据人群资料和动物实验资料,2002年国际癌症研究中心(IARC)将含马兜铃属植物的中草药列为对人的第一类致癌物。据报道,鼠伤寒沙门氏菌(Salomonella typhimurium)回复突变试验结果表明,AA对TA100、TA1537、TA102菌株是直接致突变物。果蝇试验结果表明,AA能引起伴隐性致死(SLRL)、精细胞染色体缺失、幼虫体细胞基因重排。在体外培养哺乳动物细胞中AA能造成6-硫鸟嘌呤抗性突变、姐妹染色单体互换(SCE)、染色体畸变等结果阳性。AA还可造成CHO细胞、小鼠骨髓瘤细胞、猪上皮细胞、人淋巴细胞和hepg2细胞的DNA损伤,从而导致遗传毒性。目前对其机制研究表明,AA的遗传毒性及致癌性可能与AA与DNA形成加合物有关。活性氮(Reactive Nitrogen Species, RNS)包括一氧化氮(NO)及其同系物如过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等对DNA造成损伤从而导致炎症、遗传毒性和致癌性的研究越来越引起人们的重视。受此启发,我们对RNS是否也参与AA引起hepg2细胞的DNA损伤,从而导致遗传毒性进行了进一步的探讨。本研究选用的hepg2细胞是来源于人类的肝癌细胞系,它保存了较完整的生物转化代谢酶的活性,是检测外来化合物遗传毒性的理想细胞系。通过此试验系统对AA引起的遗传毒性以及活性氮对DNA造成的损伤进行研究,进一步为揭示AA的遗传毒性和致癌性提供实验依据。方法:以hepg2细胞作为试验系统。噻唑蓝(MTT)比色法检测AA的细胞毒性。单细胞凝胶电泳(SCGE)试验检测AA对DNA造成的损伤。微核(MN)试验检测细胞染色体损伤的情况。2,3-二氨基萘(DAN)法测定细胞内亚硝酸盐水平,从而间接的反映细胞内NO的生成情况。免疫组化方法检测细胞内8-OHdG的表达情况,间接的反映细胞内ONOO-的生成情况。结果:AA对hepg2细胞的生长抑制率随着其浓度的增加而增加,接触24和48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为132.24和62.2μM。hepg2细胞接触25-200μM ?的AA 1 h后,DNA断裂形成的彗星样的拖尾、尾DNA含量及尾矩明显增大,呈剂量依赖关系,提示DNA链发生明显断裂,且随着AA浓度的增高断裂程度逐渐增加。hepg2细胞与12.5-50μM的AA接触24 h后,细胞微核率明显高于未用AA处理的细胞,且存在剂量依赖关系。细胞接触50-200μM ?的AA 1 h后,可引起细胞内亚硝酸盐的水平明显增加。50-200μM的AA作用hepg2细胞3 h后,导致8-OHdG的表达明显升高。结论:AA对hepg2细胞具有细胞毒性,通过彗星试验和微核试验表明AA能引起hepg2细胞DNA链的断裂和染色体的损伤。较高浓度的AA可诱发hepg2细胞内NO水平和8-OHdG的表达明显升高。以上结果提示AA对hepg2细胞具有遗传毒性可能与NO及其同系物ONOO-等RNS所引起的DNA损伤有关。

关键词：马兜铃酸遗传毒性活性氮 hepg2细胞系

STYK1/NOK对hepg2及Huh-7细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响

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STYK1/NOK对HepG2及Huh-7细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响

作者：高婧雅天津医科大学

学位级别：硕士

目的:研究STYK1/NOK基因在肝癌细胞系hepg2(肝母细胞瘤来源)和Huh-7(肝细胞肝癌来源)中的作用并明确其作用机制。探讨过表达STYK1/NOK对hepg2细胞凋亡、细胞增殖的影响,反向验证,抑制STYK1/NOK蛋白表达对hepg2细胞凋亡、增殖及细胞周期... 详细信息

目的:研究STYK1/NOK基因在肝癌细胞系hepg2(肝母细胞瘤来源)和Huh-7(肝细胞肝癌来源)中的作用并明确其作用机制。探讨过表达STYK1/NOK对hepg2细胞凋亡、细胞增殖的影响,反向验证,抑制STYK1/NOK蛋白表达对hepg2细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响。随后,在Huh-7细胞中验证,明确STYK1/NOK对肝癌细胞系细胞增殖的影响,以期揭悉STYK1/NOK影响肝癌细胞增殖的具体作用机制。方法:在hepg2细胞中过表达STYK1/NOK,通过western blotting检测蛋白表达情况,确定STYK1/NOK过表达。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测分别转染0,2,6μg STYK1/NOK质粒的hepg2细胞的凋亡情况,每组重复3组,根据检测结果制作柱形图。转染0,2,6μg STYK1/NOK质粒,48小时后,应用CCK8细胞增殖实验检测过表达STYK1/NOK对hepg2细胞增殖的影响,每组重复三组,随后应用OD值制作柱形图。为了明确检测结果,应用siRNA抑制hepg2细胞STYK1/NOK蛋白表达后行细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期实验,并采用western blotting检测凋亡相关蛋白caspase 3,cleaved-caspase3及凋亡周期蛋白CDC25A,CDK2蛋白的表达情况,明确STYK1/NOK对hepg2细胞凋亡及细胞周期的影响。并进一步明确具体作用机制。随后,相关实验在另一株肝癌细胞系Huh-7细胞中进行验证。过表达STYK1/NOK及通过应用siRNA抑制Huh-7细胞STYK1/NOK蛋白表达后,行细胞凋亡实验,并应用western bloting检测抑制STYK1/NOK细胞凋亡相关蛋白caspase 3及cleaved-caspase 3的表达情况,再进一步检测抑制STYK1/NOK蛋白表达后的细胞周期分布情况。结果:在转染48h后,收集细胞,提取蛋白,行western blotting检测,检测结果表明STYK1/NOK的表达与转染的质粒浓度相关,呈剂量依赖效应。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测过表达后hepg2细胞凋亡情况,结果发现在转染0,2,6μg STYK1/NOK质粒组,细胞凋亡百分比逐渐减少,分别为21.1%,19.7%,16.3%,重复三组,应用t检验统计,具有统计学意义(Phepg2细胞的凋亡。应用CCK8细胞增殖实验进行检测,研究过表达STYK1/NOK基因对细胞增值的影响。在转染48 h后,加入CCK8试剂,2 h后进行检测,结果发现过表达STYK1/NOK促进hepg2细胞增殖。为了进一步验证实验结果,应用siRNA抑制hepg2细胞STYK1/NOK蛋白表达,再次行细胞凋亡实验,实验结果表明抑制STYK1/NOK蛋白表达促进细胞凋亡,分别转染0,2,6μg si-STYK1/NOK质粒,凋亡率分别为30.2%,30.6%,36.5%。每组重复三组,行t检验,发现转染0μg si-STYK1/NOK质粒组和转染6μg si-STYK1/NOK质粒组凋亡率差异具有统计学意义(P细胞增殖实验结果表明,抑制STYK1/NOK抑制hepg2细胞增殖(Phepg2细胞凋亡。细胞周期结果表明,抑制STYK1/NOK蛋白表达后,S期细胞增多,G0/G1、G2/M期细胞减少,Western blotting结果表明抑制STYK1/NOK蛋白表达后,CDC25A蛋白和CDK2蛋白表达下调,表明抑制STYK1/NOK将hepg2细胞阻滞在S期,从而抑制细胞增殖。随后,检测结果在Huh-7细胞中进行验证,细胞凋亡实验、细胞周期实验结果均与hepg2结果相符。抑制Huh-7细胞STYK1/NOK蛋白表达后,通过裂解活化caspase 3促进细胞凋亡。结论:研究表明抑制STYK1/NOK促进hepg2和Huh-7细胞凋亡,裂解活化凋亡执行蛋白caspase 3,抑制hepg2细胞增殖。抑制hepg2细胞STYK1/NOK蛋白表达后,细胞周期检测结果显示S期细胞明显增多,细胞周期相关蛋白CDC25A和CDK2表达下调,表明抑制STYK1/NOK将细胞阻滞在S期,抑制细胞周期进展,抑制细胞增殖。相反的,研究结果表明STYK1/NOK可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。实验结果表明,STYK1/NOK可能成为肝癌治疗的靶向基因,但由于本研究主要是在

关键词： hepg2细胞系 Huh-7细胞系 STYK1/NOK 细胞凋亡细胞增殖细胞周期

金纳米荷载白藜芦醇的制备表征及抗肝癌作用研究

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金纳米荷载白藜芦醇的制备表征及抗肝癌作用研究

作者：张朵朵西南大学

学位级别：硕士

癌症作为一个日益严重的全球健康问题,每年都影响着数百万人。其中,肝癌是世界上第五大常见恶性肿瘤,也是导致死亡的第二大原因。在临床医生和科学家的共同努力下,肝癌的总体生存率得以延长。然而,在治疗过程中,放疗和化疗药物造成的的... 详细信息

癌症作为一个日益严重的全球健康问题,每年都影响着数百万人。其中,肝癌是世界上第五大常见恶性肿瘤,也是导致死亡的第二大原因。在临床医生和科学家的共同努力下,肝癌的总体生存率得以延长。然而,在治疗过程中,放疗和化疗药物造成的的不良反应,大大降低了患者的生存率。因此,迫切需要研究新的药物来提高我们诊断、预防和治疗肝癌的能力。纳米粒子作为运载工具为医学诊断和治疗提供了巨大的潜力。银纳米和金纳米具有良好的生物相容性、低毒性和功能多样性,并且在生物医学领域有着广泛的应用。由于金纳米颗粒表面积大,能被多种治疗药物包覆,因此在药物传递系统中具有广阔的应用前景。最近的研究表明,金纳米颗粒已被报道应用于抗肿瘤治疗,包括癌症抗原和佐剂的传递。根据金纳米颗粒的特性,本实验室猜想纳米技术是否可以应用于增强白藜芦醇的抗肿瘤作用。白藜芦醇是一种天然的化合物,存在于浆果、坚果、虎杖和葡萄中。近年来,大量的研究表明白藜芦醇具有多种药理学效应,包括潜在的抗癌、抗炎、心脏保护和神经保护活性。但是,白藜芦醇难溶于水和生物利用度低的特点大大限制了它的应用。目前,有很多研究者通过对白藜芦醇进行修饰来改善它的缺点。基于这些发现,本课题在体外和体内进行了一系列研究,以探讨金纳米颗粒是否可用于增强Res的抗肿瘤作用。本实验利用白藜芦醇自身具备的还原性,以白藜芦醇和氯金酸溶液为原料,在37℃、质量比为1:2、反应时间为120 min的条件下,一步法制备粒径均一、分散性良好的金纳米荷载白藜芦醇。紫外光谱结果表明金纳米荷载白藜芦醇的等离子共振吸收峰在539 nm处出现。透射电镜实验结果表明通过调节反应温度、时间和质量比可以得到粒径在39 nm的金纳米荷载白藜芦醇。另外,红外光谱实验数据表明金与白藜芦醇酚羟基结构中氧的协同作用,使白藜芦醇包裹在金纳米粒子表面,白藜芦醇中的碳碳双键和羟基得到了保留,并且已有大量研究表明碳碳双键和羟基在白藜芦醇发挥很多药理作用中起到重要的作用。因此,我们预测金纳米荷载白藜芦醇可能具有白藜芦醇的部分药理作用和金纳米颗粒的优良特性,在抗肿瘤方面具有良好的应用前景。MTT实验检测白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇对hepg2细胞生长的影响;AO染色法检测药物对肝癌细胞形态的影响;流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡情况;透射电镜检测金纳米荷载白藜芦醇在hepg2细胞内的分布情况;蛋白印迹免疫法(Western Blot)检测Caspase家族和PI3K/Akt等相关凋亡蛋白的变化;MTT实验检测白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇对正常肝细胞L02和肾小球系膜GMCs细胞的毒性作用。在以上实验的基础上,用BALB/c裸鼠构建人肝癌hepg2细胞荷瘤模型,持续给予药物42天,处死荷瘤裸鼠,剥离瘤体,HE染色观察肿瘤组织的形态学变化;Tunel染色检测肿瘤组织中细胞凋亡的情况;免疫组化法检测瘤体中血管生长因子(VEGF)的表达。摘取动物的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,HE切片染色观察受试物对上述器官组织形态学改变的影响,同时用MTT法检测药物对L02和GMCs细胞的毒性。MTT结果表明白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇对hepg2细胞均具有明显的抑制作用,并且金纳米荷载白藜芦醇的抑制作用更显著。白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇处理hepg2细胞24 h后,半数抑制浓度(IC)分别为27.74g/ml和3.84g/ml,为了进一步检测白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇对L02细胞和GMCs细胞的毒性作用,分别用白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇处理24 h,金纳米荷载白藜芦醇对L02细胞和GMCs细胞的抑制率依次为35%和10%,而白藜芦醇组的抑制率依次为83%和63%。AO染色结果表明两种药物均能够促进细胞凋亡,导致细胞发生形态学改变,给药后hepg2细胞的细胞核膜皱缩,细胞体积变小而呈绿色的荧光,凋亡细胞呈碎片状。随着给药浓度的递增,其凋亡细胞数也相应增加。透射电镜结果表明功能化的金纳米荷载白藜芦醇在细胞内大量积累,并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。流式细胞仪结果也表明细胞的凋亡有显著的剂量依赖性。WB检测相关蛋白发现,金纳米荷载白藜芦醇可显著上调激活的caspase-3、caspase-8、caspase-9与bax和下调PI3K与Akt的表达。白藜芦醇对上述蛋白的调节也呈相同趋势,但调节作用弱于金纳米荷载白藜芦醇。荷瘤实验结束后,剥离瘤体并称重。发现白藜芦醇和金纳米荷载白藜芦醇对瘤体的生长均有较强抑制作用。白藜芦醇组和金纳米荷载白藜芦醇组中裸鼠移植瘤体的体积和重量均明显的降低,对瘤重的抑制率分别为35.5%和57.2%。荷瘤组织经HE染色后,结果显示,模型组肿瘤组织中的细胞排列整齐,细胞形态完整;给药组的细胞随着浓度的递增细胞数量逐渐减少,细胞核膜皱缩,呈均匀蓝色,相较于白藜芦醇组,金纳米荷载白藜芦醇组诱

关键词：白藜芦醇金纳米荷载白藜芦醇表征 hepg2细胞系移植瘤

黄绿青霉毒素对hepg2细胞的DNA损伤毒性及氧化应激机制的研究

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黄绿青霉毒素对HepG2细胞的DNA损伤毒性及氧化应激机制的研究

作者：白云涛大连医科大学

学位级别：硕士

前言：黄绿青霉毒素（citreoviridin, CIT）是主要由黄绿青霉菌（Penicilliumcitreoviridin）产生的具有毒性的次级代谢产物。CIT广泛存在于霉变作物中，例如霉变的谷物，大米，玉米等。研究发现黄绿青霉菌在大米中生长速度最快，产毒... 详细信息

前言：黄绿青霉毒素（citreoviridin, CIT）是主要由黄绿青霉菌（Penicilliumcitreoviridin）产生的具有毒性的次级代谢产物。CIT广泛存在于霉变作物中，例如霉变的谷物，大米，玉米等。研究发现黄绿青霉菌在大米中生长速度最快，产毒数量也最高。温度与环境中的PH值对黄绿青霉菌的生长及产毒有着密切影响。 CIT最早引起人们关注是在100多年前的日本。1891年，日本学者Sakaki发现用发霉的大米喂养实验动物会导致其出现中枢神经系统麻痹的症状。1920年，日本学者Miyake和Takada首次报道了来自霉变食物的青霉菌属（Penicilliumcommune）引起实验动物兔和老鼠的病变。随后Miyake等人从日本本土大米和台湾大米中提取出了一种真菌并命名为黄绿青霉菌（P. citreonigrum）。该菌株可产生一种毒性很强的代谢产物即黄绿青霉毒素。 CIT可通过干扰受试老鼠脑部的糖代谢进而导致中枢神经系统功能障碍。研究认为CIT的毒性效应源于其导致的呼吸系统及心血管系统的损伤，如呼吸暂停、脑电图异常、窦性心律失常、低血压等，从而出现由于主动脉组织缺氧而导致的中枢神经系统症状。CIT可致大鼠心肌原发性坏死，心肌细胞呈颗粒状变性，心肌纤维凝集，溶解。CIT可结合并抑制线粒体中的三磷酸腺苷合成酶。研究认为CIT与“黄变米中毒”，“心源性脚气病”以及克山病有着密切关系。 CIT可致心肌细胞，人胃癌细胞(SGC-790)DNA损伤。但具体机制尚不清楚。本研究选用hepg2细胞，探讨CIT的DNA损伤毒性及其可能机制。hepg2细胞来源于人类肝胚细胞瘤，分化程度较高，不仅保留了人类正常肝实质细胞的许多功能和特点，还保留了较完整的生物转化代谢Ⅰ相酶和Ⅱ相酶。被认为是用来检测外来化合物DNA损伤毒性的理想细胞系。CIT为亲脂性毒素，吸收后在肝脏中浓度最高。这也就是我们采用hepg2细胞作为该试验系统的原因之一。本研究选用hepg2细胞，探讨CIT的DNA损伤毒性及其可能机制，旨在为评估CIT对人类健康的潜在危害提供实验室依据。方法：本研究选用hepg2细胞作为试验系统。通过单细胞凝胶电泳（SCGE）试验检测细胞DNA损伤情况，评价CIT的DNA损伤毒性。为探讨其可能的DNA损伤毒性机制，以2＇，7＇—二氢二氯荧光素(DCFH)法测定细胞内ROS水平，以苯二醛（OPT）测定细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平，以免疫组化方法检测细胞内8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达水平，用吖啶橙（Acridine orange）和罗丹明123（Rhodamine123）分别测定细胞内溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变水平。实验结果用SPSS v11.5统计软件包进行统计分析。结果：2.5-5μM的CIT作用于hepg2细胞1h后，引起细胞DNA链断裂，细胞形成彗星样拖尾，其尾DNA%明显大于未用CIT处理的细胞。2.5-5μM的CIT染毒60min引起细胞内ROS水平明显增加，GSH水平显著降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P hepg2细胞内ROS水平增加，对CIT所致hepg2细胞DNA损伤具有保护作用。 1.25-5μM CIT作用于hepg2细胞3h后，可致8-OHdG的表达升高;1.25-5μM的CIT作用于hepg2细胞60min后，可引起细胞内溶酶体膜稳定性明显改变;5μM的CIT作用60min引起细胞内线粒体膜电位的改变，与对照组比较，其差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：CIT可引起hepg2细胞DNA损伤，提示CIT对hepg2细胞具有DNA损伤毒性。CIT可诱发细胞内ROS水平增高，GSH水平降低，提示CIT对hepg2细胞产生的DNA损伤毒性可能与氧化应激机制有关。N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理60min后可降低CIT引起的hepg2细胞内ROS水平增加，对CIT所致hepg2细胞DNA损伤具有保护作用。CIT作用于细胞后导致氧化性DNA损伤的标志性产物8-OHdG形成增强，进一步表明CIT引起hepg2细胞的DNA损伤为氧化性损伤。此外，CIT对hepg2细胞溶酶体膜稳定性有显著影响，并使得hepg2细胞线粒体膜电位显著降低。

关键词：黄绿青霉毒素 hepg2细胞系 DNA损伤毒性氧化性DNA损伤溶酶体膜稳定性