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Construction and characterization of an HCV-derived multi-epitope peptide antigen containing B-cell hvr1 mimotopes and T-cell conserved epitopes

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Science China(Life Sciences) 2006年第5期49卷 490-499页

作者： GAO Jun1,2,GONG Yuping1,ZHAO Ping1,ZHU Qing3,YANG Xiaoping1 & QI Zhongtian1 1.Department of Microbiology,Stake Key Laboratory of Medical Immunology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China 2.Department of Gastroenterology,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China 3.Department of Epidemiology,Naval Medical Research Institute,Shanghai 200433,China Department of Microbiology Stake Key Laboratory of Medical Immunology Second Military Medical University Shanghai 200433 China Department of Gastroenterology Changhai Hospital Second Military Medical University Shanghai 200433 China Department of Microbiology Stake Key Laboratory of Medical Immunology Second Military Medical University Shanghai 200433 China Department of Epidemiology Naval Medical Research Institute Shanghai 200433 China

Hepatitis C(HCV) genome is highly variable,particularly in the hypervariable region 1 (hvr1) of its E2 envelope gene.The variability of HCV genome has been a major obstacle for de-veloping HCV vaccines.Due to B-cell hvr1 mimotopes mimicking the antigenicity of natural hvr1 epitopes and some T-cell epitopes from the consensus sequence of HCV genes conserving among the different HCV genotypes,we synthesized an minigene of HCV-derived multi-epitope peptide an-tigen(CMEP) ,which contains 9 B-cell hvr1 mimotopes in E2,2 conserved CTL epitopes in C,1 conserved CTL epitope in NS3 and 1 conserved Th epitope in NS3.This minigene was cloned into a GST expression vector to generate a fusion protein GST-CMEP.The immunogenic properties of CEMP were characterized by HCV infected patients' sera,and found that the reactivity frequency reached 75%.The cross reactivity of anti-CEMP antibody with different natural hvr1 variants was up to 90%.Meanwhile,we constructed an HCV DNA vaccine candidate,plasmid pVAX1.0-st-CMEP carrying the recombinant gene(st) of a secretion signal peptide and PADRE universal Th cell epitope sequence in front of the CMEP minigene.Immunization of rabbits with pVAX1.0-st-CMEP resulted in the production of antibody,which was of the same cross reactivity as the fusion protein GST-CMEP.Our findings indicate that the HCV-derived multi-epitope peptide antigen in some degree possessed the characteristics of neutralizing HCV epitopes,and would be of the value as a candidate for the development of HCV vaccines.

关键词： hepatitis C virus multi-epitope peptide hvr1 mimotopes T-cell conserved epitopes

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Antigenicity of the HCV hvr1 Peptide Analyzed by Computer Modeling

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Journal of Microbiology and Immunology 2003年第1期1卷 25-28页

作者：郑宇苏琴林芳赵军何卫平李伯安李静高蓉程云 Department of Immunology Institute of Infectious Disease 302 Hospital of People's Liberation ArmyBeijing 100039 China

To find out the protective polypeptide epitopes of HCV hvr1, the antigenicity of the synthetic peptide was predicted by computer modeling and verified by ELISA and lymphocyte transformation test. It was found that the outcome of the computer modeling was in accord with the experimental results. The method by using computer modeling would be a economic approach by which the protective peptides could be identified quickly.

关键词：抗原性 HCV hvr1 缩氨酸计算机模型淋巴细胞丙肝高变区基因多肽

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丙型肝炎病毒E2蛋白hvr1在体液免疫应答中的作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第8期29卷 714-715页

作者：乐爱平陈志辉童一民邵圣文南昌大学第一附属医院输血科 330006 第二军医大学长海医院感染科第二军医大学微生物学教研室湖州师范学院医学院创新实验室

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝硬化、肝癌的高危险因素，目前尚无HCV疫苗上市。HCV包膜E2蛋白能诱导机体产生中和抗体，是重要的候选疫苗成分。E2蛋白氨基末端由27个氨基酸残基组成的高变区1（hypervariable region1，hvr1）含有多个线... 详细信息

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝硬化、肝癌的高危险因素，目前尚无HCV疫苗上市。HCV包膜E2蛋白能诱导机体产生中和抗体，是重要的候选疫苗成分。E2蛋白氨基末端由27个氨基酸残基组成的高变区1（hypervariable region1，hvr1）含有多个线性中和抗体表位，变异频率极高，增加了HCV疫苗研制的难度。近年发现，除了hvr1含有中和抗体表位外，E2蛋白还存在其他的保守空间构象和线性中和抗体表位心。本研究构建了羧基端截短的含有hvr1和缺失hvr1的E2蛋白真核表达质粒，以之免疫小鼠，分析hvr1在E2蛋白诱导的小鼠体液免疫应答中的作用。

关键词：体液免疫应答丙型肝炎病毒 E2蛋白 hvr1 HCV疫苗氨基酸残基抗体表位真核表达质粒

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皖南地区丙型肝炎病毒治疗前后hvr1区碱基变异数量的研究

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中国微生态学杂志 2010年第7期22卷 628-630页

作者：李小宁皖南医学院弋矶山医院检验科安徽芜湖241001

目的研究皖南地区丙型肝炎病毒治疗前后高变区1(hvr1)碱基变异数量与病情变化和治疗效果之间是否具有相关性。方法应用速率法和荧光定量PCR法,检测皖南地区141例慢性丙型肝炎患者血清ALT水平和HCV RNA的载量。应用RT-PCR法进行HCV基因... 详细信息

目的研究皖南地区丙型肝炎病毒治疗前后高变区1(hvr1)碱基变异数量与病情变化和治疗效果之间是否具有相关性。方法应用速率法和荧光定量PCR法,检测皖南地区141例慢性丙型肝炎患者血清ALT水平和HCV RNA的载量。应用RT-PCR法进行HCV基因型和治疗前后的hvr1区域序列的检测。结果 141例患者的血清ALT与HCV RNA两指标间采用Spearman等级相关分析显示,rs=0.213,P=0.011,差异具有统计学意义,存在正相关。通过HCV基因1型、2型和未分型3组的hvr1碱基变异数量的单因素方差分析,显示组与组之间差异具有统计学意义。结论慢性丙型肝炎患者治疗前后的hvr1序列碱基变异数量的分析,对治疗效果、病情变化及预后发展等方面的评估具有重要的指导意义。

关键词：丙型肝炎 HCVRNA hvr1

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高变区1中和表位在HCV免疫逃逸中的作用

高变区1中和表位在HCV免疫逃逸中的作用

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作者：彭浩然第二军医大学

学位级别：硕士

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种有包膜的单正链RNA病毒，隶属于黄病毒科，丙型肝炎病毒属;主要经血传播，是引起急、慢性肝炎的重要病原体之一。HCV感染是一个全球性的公共卫生问题，目前全球HCV感染者约为1.6亿，每年... 详细信息

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种有包膜的单正链RNA病毒，隶属于黄病毒科，丙型肝炎病毒属;主要经血传播，是引起急、慢性肝炎的重要病原体之一。HCV感染是一个全球性的公共卫生问题，目前全球HCV感染者约为1.6亿，每年新增感染者约有二百万。高达80%的HCV感染者发展为慢性感染，HCV慢性感染是引起肝硬化、肝细胞癌的重要原因之一。此外，HCV慢性感染还与多种肝外疾病，如糖尿病、淋巴瘤、肾小球肾炎、混合性冷球蛋白血等症相关。 HCV RNA聚合酶无校对功能，致使其基因组在复制过程中易产生突变。根据基因组核苷酸序列的异质性，HCV被分为7个不同的基因型，每个基因型又被分为若干亚型。受各蛋白在HCV复制周期中功能的限制，HCV基因组中的变异呈现明显的不平衡分布。HCV各蛋白中，以包膜蛋白的变异性最高，这由包膜蛋白是诱导中和抗体的靶抗原的特性所决定。HCV包膜蛋白由E1和E2两个亚基通过非共价键形成异源二聚体所构成，其中位于E2氨基末端的27个氨基酸残基是包膜蛋白中变异频率最高的区域，该区域被称为高变区1（hypervariableregion1, hvr1）。hvr1是最早发现的HCV中和表位所在区域，该区域的变异被认为是HCV免疫逃逸和持续感染的重要原因，也是丙肝疫苗研发一直面临的瓶颈。hvr1高度暴露于HCV包膜蛋白的表面，是病毒与B类I型清道夫受体（scavenger receptor class B type I, SR BI）作用的关键区域，高密度脂蛋白（HDL）增强HCV的细胞侵入依赖于hvr1的存在，因而hvr1在HCV的细胞入侵过程中起重要作用。 HCV患者外周血以及细胞培养体系中的HCV颗粒表面均不同程度结合有脂蛋白，这使得HCV颗粒呈现低密度特性以及明显的密度不均一性。HCV颗粒的感染性与其密度负相关，这提示HCV颗粒表面结合的脂蛋白有助于增强HCV的感染性。最近有研究显示，hvr1参与调节HCV颗粒与脂蛋白的结合，从而影响HCV的感染性与逃逸中和免疫。综上，hvr1在HCV的感染和免疫逃逸中起重要调控作用。我们前期在1a型的H77株，1b型的Con1株HCV包膜蛋白的hvr1中均分别鉴定出三个相对独立的不同微功能域：感染决定区，决定HCV包膜蛋白与SR BI受体的结合，该区的缺失导致HCV假病毒颗粒（HCV pseudotyped particles, HCVpp）的感染性彻底丧失，缺失该区的单个氨基酸残基能降低HCVpp感染性的70%以上，但单个氨基酸残基的替换突变并不明显改变HCVpp的感染性;感染调节区，删除该区域仅有限降低HCVpp的感染性，该区域内的突变可改变HCVpp的感染性;多功能区，为hvr1中的中和表位，删除该区增强或有限降低HCVpp的感染性，但消除了HDL对HCV细胞入侵的增强作用以及肝素与E2的结合活性，并增强E2抗体的中和活性。本研究中，我们根据H77原型株HCV患者血清hvr1序列历经13年以后的变异情况对我们上述的hvr1功能分区进行再次评价，并用细胞培养来源的HCV（HCV derived from cell culture, HCVcc）为模型进一步探讨多功能区，即中和表位的其他功能，本研究结果推进了对HCV逃避体液免疫应答机制的认识，并为HCV疫苗的研发提供了新思路。第一部分H77株HCV hvr1间隔13年后的序列变异对其功能的影响美国NIH Purcell教授对一名于1977年初次诊断为经血传播的非甲非乙型肝炎患者（后证实是HCV感染）在急性期以及慢性期多个时间点的HCV基因进行了克隆和测序，使该患者的血清序列成为HCV变异、中和免疫等研究的经典材料。前期我们以该患者1977年急性期的E1E2序列（H77株）中的hvr1进行的功能研究显示，在该株病毒的hvr1中存在三个相对独立的微功能域;本研究中，我们分析了该患者历经13年以后，即1990年从该患者血清扩增出的E1E2（H90株）中hvr1序列变异对其免疫原性和包装出的HCVpp感染性的影响。比较H77株的hvr1序列（ETHVTGGSAG HTTAGLVGLLTPGAKQN）与H90株hvr1序列（ETHVTGGSAG HSVLGIASFLTRGPKQN），发现共有9个氨基酸（aa1214、aa1619、aa22、aa24）发生了突变。我们在H77株E1E2序列中分别引入三种突变：突变1，将H90株hvr1的aa1214引入H77株hvr1;突变2，将H90株hvr1的aa1619、aa22及aa24引入H77株hvr1;突变3，将H90株hvr1的全部9个氨基酸突变引入H77株hvr1。比较三种hvr1突变的E1E2与H77株原型E1E2在293T细胞内的表达水平、组装产生假病毒颗粒的效率、HCVpp的感染性以及H77株hvr1抗体对各假病毒的中和活性。分别将三种突变质

关键词：丙型肝炎病毒 hvr1 免疫逃逸感染性

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HCVE2区基因的分子克隆及序列分析

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中国病毒学 2001年第1期16卷 40-44页

作者：张东伟梁布锋祁自柏凌世淦中国科学院武汉病毒研究所湖北武汉430071 中国药品生物制品检定所北京100050 军事医学科学院北京100850

用RT PCRKIT从西安血站大样抗HCV阳性血清中筛选出HCVRNA阳性血清 ,提取HCV的RNA ,利用随机引物反转录合成其cDNA并进行半巢式PCR反应。将纯化的PCR产物酶切后与表达载体PET 2 2b+连接 ,经过双脱氧末端终止法双向测序 ,得到 85 2bp长的... 详细信息

用RT PCRKIT从西安血站大样抗HCV阳性血清中筛选出HCVRNA阳性血清 ,提取HCV的RNA ,利用随机引物反转录合成其cDNA并进行半巢式PCR反应。将纯化的PCR产物酶切后与表达载体PET 2 2b+连接 ,经过双脱氧末端终止法双向测序 ,得到 85 2bp长的核苷酸序列。通过将该序列与已知不同型的HCVE2序列比较得知。

关键词：丙型肝炎病毒 E2包膜糖蛋白 hvr1 序列特征

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1例慢性丙型肝炎肝移植术后HCV hvr1序列动态观察

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云南医药 2006年第5期27卷 509-509页

作者：李峥杜廷义高玉红台虹云南省第一人民医院云南省临床检验中心云南昆明650032

病例：患者，男性、已婚、汉族、65岁、干部、籍贯山东。1977年诊断为丙型肝炎肝硬化。2004年10月在云南省第一人民医院诊断为“慢性丙型肝炎，肝硬化失代偿期”，并行背驮式肝移植。术前检查乙型肝炎病毒表面抗体阳性、抗HCV抗体阳性、... 详细信息

病例：患者，男性、已婚、汉族、65岁、干部、籍贯山东。1977年诊断为丙型肝炎肝硬化。2004年10月在云南省第一人民医院诊断为“慢性丙型肝炎，肝硬化失代偿期”，并行背驮式肝移植。术前检查乙型肝炎病毒表面抗体阳性、抗HCV抗体阳性、HCV—RNA阳性。肝移植后随访一般健康状况良好，生活质量和精神状况稳定。术后定期检测肝功能肝胆酶谱一直保持在正常范围，抗-HCV及HCV—RNA检测均为阳性。肝移植后使用免疫抑制剂PK-506，使用剂量肝移植后1～6个月内维持血药浓度在10ng／ml，7～12个月维持在5～10ng／ml，至今仍维持在5～10ng／ml。选择患者肝移植前血清标本一份、肝移植后血清标本四份做丙肝病毒基因型及HUR1序列检测。

关键词：慢性丙型肝炎肝移植术后抗HCV hvr1 序列表面抗体阳性动态观肝硬化失代偿期

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